右旋美托咪啶引起腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR間接激活.pdf

1、右旋美托咪啶(Dexmedetomidine)是α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，它與α2-腎上腺素能受體特異性結(jié)合的能力是與α1-腎上腺素能受體結(jié)合的1600倍，也比可樂(lè)定高出幾倍。右旋美托咪啶除了有鎮(zhèn)靜催眠作用外，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)腦缺血后，低濃度的右旋美托咪啶具有神經(jīng)保護(hù)作用。這可能與它能激活Gi/o蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的α2-腎上腺素能受體有關(guān)。 目前研究表明，在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶(Dex

2、medetomidine)通過(guò)上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，epidermalgrowthfactorreceptor)間接激活引起細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化，此間接激活途徑能被金屬蛋白酶抑制劑GM6001和EGFR抑制劑AG1478所抑制。本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)蓚€(gè)問(wèn)題：(1)α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑是否在整體動(dòng)物腦組織和腦片上引起與在星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR間接激活相似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑；(2)α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑在神經(jīng)元上是否引起E

3、GFR間接激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 方法采用整體動(dòng)物腹腔注射藥物、腦片培養(yǎng)及原代培養(yǎng)神經(jīng)元方法。整體動(dòng)物腹腔注射右旋美托咪啶，7min或15min后斷頭，取出腦組織在裂解液中勻漿；腦片培養(yǎng)2h后，培養(yǎng)液里分別加入AG1478、GM6001、阿替美唑或肝素其中一種抑制劑孵育，在培養(yǎng)箱中孵育15min，然后加入50nM右旋美托咪啶，孵育20min后。在裂解液中勻漿；原代培養(yǎng)7d的神經(jīng)元，對(duì)照組和DEX組分別加入PBS和50nM右旋美托咪

4、啶，在37℃的培養(yǎng)箱中孵育20min，加入裂解液，收集細(xì)胞。勻漿后的樣品進(jìn)行免疫凝膠電泳和Western印跡法半定量測(cè)定ERK1/2磷酸化。使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-wayANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、整體動(dòng)物：7min后在DEX組ERK1/2磷酸化比對(duì)照組有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。注射右旋美托咪啶15min后，DEX組ERK1/2

5、磷酸化高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2、腦片：右旋美托咪啶濃度曲線，右旋美托咪啶在25nM時(shí)ERK1/2磷酸化只有輕度升高，差異較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而在50nM和100nM時(shí)ERK1/2磷酸化有顯著升高，差異較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。金屬蛋白酶抑制劑GM6001存在時(shí)，DEX+GM6001組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明右旋美托

6、咪啶引起ERK1/2磷酸化可以被GM6001所抑制。EGFR抑制劑AG1478存在時(shí)DEX+AG1478組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組。并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明右旋美托咪啶引起ERKi/2磷酸化可以被AG1478所抑制。HB-EGF拮抗劑肝素存在時(shí)DEX+肝素組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明右旋美托咪啶引起ERK1/2磷酸化可被肝素抑制。α2-腎上腺素能受體抑制劑阿

7、替美唑存在時(shí)DEX+阿替美唑組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化可被阿替美唑所抑制。 3、神經(jīng)元：與在腦片觀察到的結(jié)果相反，右旋美托咪啶在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元上沒(méi)有引起ERK1/2磷酸化的變化(P＞0.05)。 討論金屬蛋白酶抑制劑GM6001、EGFR抑制劑AG1478、HB-EGF拮抗劑肝素均能抑制右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化，

8、這說(shuō)明右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化是由于HB-EGF的脫落和EGFR的激活。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)在整體動(dòng)物和離體腦片為研究對(duì)象進(jìn)行EGFR間接激活的研究。肝素抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HB-EGF是被釋放的EGFR配體之一。但并不能說(shuō)明只有HB-EGF一種配體被釋放。EGFR至少可以被6種配體激活，它們分別是EGF、HB-EGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、雙調(diào)蛋白、β-細(xì)胞素、表皮調(diào)節(jié)素。在腦組織最初發(fā)育階段，HB-EGF表達(dá)水平高，此后下降。但是有人發(fā)

9、現(xiàn)HB-EGF的表達(dá)在小腦持續(xù)存在，且最近有實(shí)驗(yàn)證實(shí)HB-EGF在其它部位包括大腦皮質(zhì)中也有表達(dá)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α在成熟腦內(nèi)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。雙調(diào)蛋白也被證實(shí)在腦內(nèi)有表達(dá)。而出生后EGF在腦內(nèi)表達(dá)很少，并且β-細(xì)胞素和表皮調(diào)節(jié)素在CNS中沒(méi)有表達(dá)。 右旋美托咪啶在原代培養(yǎng)神經(jīng)元上不能引起ERK磷酸化，這種現(xiàn)象與其在皮層中間神經(jīng)元不增加胞質(zhì)中游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的現(xiàn)象相吻合。然而α2-腎上腺素能受體激