香豆雌酚對新生鼠成骨細(xì)胞增殖分化活性的調(diào)控研究.pdf

1、目的：通過體外分離培養(yǎng)新生大鼠顱蓋骨原代成骨細(xì)胞，建立成骨細(xì)胞穩(wěn)定的培養(yǎng)體系；觀察不同濃度及不同時間香豆雌酚(Coumestrol)對新生大鼠原代成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)增殖分化的影響，探討香豆雌酚對成骨細(xì)胞的作用機制，為骨質(zhì)疏松治療藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗和理論依據(jù)。 方法：采用二次消化法獲得新生<24h SD大鼠原代成骨細(xì)胞，用不同濃度(0，10<'-10>M-10<'-5>M)香豆雌酚干預(yù)成骨細(xì)胞，以17

2、β-Estradiol(10<'-8>M)為陽性對照，觀察不同濃度和不同時間香豆雌酚對大鼠成骨細(xì)胞的增殖分化的影響。用MTT法測定干預(yù)后成骨細(xì)胞增殖情況；用酶消化法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)活性及培養(yǎng)液上清羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)含量變化情況；用放免法測定細(xì)胞內(nèi)骨鈣素(osteocalcin，OCN)含量；半定量RT-PCR法檢測成骨細(xì)胞內(nèi)OPG/RANKL基因的表達(dá)，

3、用免疫細(xì)胞化學(xué)法及Western Blot測定OPG蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：MTT分析結(jié)果表明，10<'-10>M-10<'-6>M香豆雌酚呈劑量依賴性促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖，干預(yù)0h、24h、48h、72h各濃度組香豆雌酚均促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖，在濃度梯度實驗中，10<'-10>M-10<'-6>香豆雌酚呈劑量依賴性促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，10<'-6>M達(dá)最大效應(yīng)，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013)，10<'-5>

4、M組細(xì)胞增殖較對照組降低，產(chǎn)生抑制作用；在時間梯度實驗中，干預(yù)48h時達(dá)最大效應(yīng)，72h后細(xì)胞增殖有所減低。10<'-10>M-10<'-6>M香豆雌酚干預(yù)48h均能輕度促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP表達(dá)，10<'-6>M達(dá)最大效應(yīng)，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.061)；不同時間香豆雌酚干預(yù)24h、48h和72h，培養(yǎng)液上清HYP含量輕度增加，其中干預(yù)48效應(yīng)最大；而干預(yù)48h，10<'-10>M-10<'-6>M香豆雌酚組HYP含量呈劑量依

5、賴性增高，其中10<'-7>M、10<'-6>M作用最大，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)；培養(yǎng)48h，成骨細(xì)胞表達(dá)骨鈣素隨香豆雌酚濃度增高而增多，其中10<'-6>M達(dá)最大效應(yīng)，與0濃度相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)；不同濃度、時間組香豆雌酚均能促使OB表達(dá)OPG mRNA表達(dá)增加，同時有輕度抑制RANKL mRNA表達(dá)的作用，其作用在48h，10<'-6>M濃度作用強度最大(P=0.038)，10<'-5>M則呈現(xiàn)抑制作用。干

6、預(yù)48小時，10<'-10>M-10<'-6>M香豆雌酚組劑量依賴性促進(jìn)OPG蛋白表達(dá)，其中10<'-6>M達(dá)最大效應(yīng)，10<'-5>M作用降低。 結(jié)論：低濃度香豆雌酚(10<'-10>M-10<'-6>M)呈劑量依賴性促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖和分化，表現(xiàn)為低濃度香豆雌酚對成骨細(xì)胞增殖以及分泌ALP、HYP、OC、OPGmRNA和蛋白等方面的促進(jìn)作用，而高濃度香豆雌酚對成骨細(xì)胞的作用降低，且其作用至少部分有OPG/RANKL途徑