香豆素類化合物對大鼠成骨細(xì)胞的細(xì)胞生物活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松(osteoporosisOP)是以骨量減少，骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征致使骨脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松一般分為兩大類：即原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。前者又分為：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausalosteoporosis，PMOP)和老年性骨質(zhì)疏松(senileosteoporosis，SOP)。PMOP是原發(fā)性骨質(zhì)疏松中的最常見類型。由于骨質(zhì)疏松癥引起的骨折等并發(fā)癥，對人們健康和生活造

2、成的嚴(yán)重威脅，重視骨質(zhì)疏松癥及其骨折的防治成為我們所面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。 OP的發(fā)生是由骨代謝異常引起的，骨組織的代謝是一個(gè)舊骨不斷被吸收，新骨不斷形成的周而復(fù)始的過程。正常成熟骨的骨代謝主要以骨重建形式進(jìn)行。骨重建的具體過程包括以破骨細(xì)胞激活、骨吸收開始和與之相偶聯(lián)的成骨細(xì)胞激活、骨形成而終結(jié)。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，能表達(dá)多種骨相關(guān)基因，分泌多種蛋白質(zhì)和多肽，其數(shù)量和活性直接影響著骨代謝

3、的平衡。 成骨細(xì)胞產(chǎn)生的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)在堿性條件下水解多種磷酸酯，并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用，有利于骨的礦化，是成骨細(xì)胞分化早期的特異性指標(biāo)，其活性反映了成骨細(xì)胞的成骨活性。 成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素(boneGlaprotein，BGP)是一種非膠原蛋白，其主要功能是與羥磷灰石結(jié)合，促進(jìn)骨的礦化。是骨形成功能的良好標(biāo)志物，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化晚期即礦化期的標(biāo)志。 成骨細(xì)胞表達(dá)雌

4、激素受體(estrogenreceptor，ER)。ER屬核受體超家族成員，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)大部分的雌激素反應(yīng)。ER包括ERα和ERβ兩種亞型。研究證實(shí)大鼠成骨細(xì)胞同時(shí)表達(dá)ERα和ERβ。 雌激素可通過ER調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生成和活性，對治療PMOP療效肯定，但其長期應(yīng)用的安全性令人擔(dān)憂。植物雌激素(phytoestrogen，PE)作為具有雌激素樣作用的一類物質(zhì)，可有效預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，同時(shí)不伴有雌激素替代療法(

5、estrogenreplacementtherapy，ERT)的并發(fā)癥，是目前治療骨質(zhì)疏松藥物的研究熱點(diǎn)之一。 中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主骨、生髓，骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”、“骨痹”的范圍，其發(fā)病的始動因素是腎精虧損。所以研究抗骨質(zhì)疏松藥物多從補(bǔ)腎藥物著手，而許多補(bǔ)腎中藥中含有植物雌激素。植物雌激素包括異黃酮類、木脂素類及香豆素類三類化合物，補(bǔ)腎中藥蛇床子和補(bǔ)骨脂中分別含有香豆素類化合物蛇床子素和補(bǔ)骨脂素，其是否對骨質(zhì)疏松有一定的防治作用

6、，是否可作為雌激素的替代藥物? 本實(shí)驗(yàn)采用成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)、分子生物學(xué)的技術(shù)和方法，研究蛇床子素和補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖、分化及ER表達(dá)的影響，旨在尋求雌激素替代藥物，并探討其治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制。 方法：1成骨細(xì)胞的培養(yǎng)用改良的組織塊法分離培養(yǎng)新生(24h內(nèi))SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞。將不同濃度的蛇床子素和補(bǔ)骨脂素加入到成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中。 2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察每日通過倒置顯微鏡觀察對照組和藥物處理組細(xì)胞的形態(tài)、生長狀況

7、之間的差別。 3利用噻唑蘭(MTT)法檢測對照組和各藥物處理組的細(xì)胞增殖。 4ALP比活性的測定用對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學(xué)法檢測ALP活性的改變。比活性用U/L表示。 5骨鈣素的測定骨鈣素的測定采用放射性免疫法(RIA)，用γ計(jì)數(shù)器測定每分鐘放射性計(jì)數(shù)(CPM)。 6成骨細(xì)胞總RNA采用異硫氰酸胍一步法提取。 7mRNA表達(dá)的定量用β-actin作為內(nèi)參照，RT-PCR測定各組成骨細(xì)胞ERβ的相對表

8、達(dá)量。 結(jié)果：1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察藥物處理組與對照組相比，細(xì)胞數(shù)量較密集，細(xì)胞間隙少，形態(tài)無明顯差異。 2蛇床子素及補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖的影響 2.1蛇床子素對成骨細(xì)胞增殖的影響在不同濃度(1×10-8mol/L～1×10-4mol/L)的蛇床子素中培養(yǎng)24h和48h，1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組與對照組相比有明顯的促增殖作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1×10-6mol/L組(P＜

9、0.05)，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組(P＜0.01)。培養(yǎng)72h后，僅1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組表現(xiàn)促增殖作用(P＜0.01)。 2.2補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖的影響在不同濃度(20μmol/L～1μmol/L)的補(bǔ)骨脂素中培養(yǎng)24h無明顯促增殖作用；培養(yǎng)48h，20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、5μmol/L濃度組產(chǎn)生顯著的促增殖作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

10、；培養(yǎng)72h，1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L有顯著的促增殖作用(P＜0.05)；培養(yǎng)96h，10μmol/L、20μmol/L，5μmol/L組表現(xiàn)出促增殖作用(P＜0.05)，1μmol/L組不表現(xiàn)促增殖作用；培養(yǎng)120h，10μmol/L、20μmol/L、5μmol/L及1μmol/L組均表現(xiàn)促增殖作用(P＜0.01)。 3蛇床子素及補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞ALP的影響3.1蛇床子素對成骨細(xì)胞ALP的影響培養(yǎng)

11、24h及48h后，均表現(xiàn)為1×10-5mol/L組與對照組相比有明顯的促進(jìn)分化作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；培養(yǎng)72小時(shí)后試驗(yàn)組與對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.2補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞ALP的影響培養(yǎng)48h、72h后，10μmol/L、15μmol/L組與對照組相比較，有明顯的促進(jìn)分化作用(P＜0.01)，培養(yǎng)72h1μmol/L時(shí)對ALP的表達(dá)呈現(xiàn)抑制作用(P＜0.05)。 4蛇床子素對成骨細(xì)胞BGP的影響培養(yǎng)48

12、h、72h后均表現(xiàn)為，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組與對照組相比有促骨鈣素表達(dá)的作用(P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞ERβmRNA表達(dá)的影響培養(yǎng)48h后，10μmol/L組、15μmol/L組及20μmol/L組ERmRNA的相對表達(dá)量分別為0.978±0.042、0.982±0.036和1.038±0.078，與對照組0.922±0.103相比均無顯著性差異，培養(yǎng)72h后，10μmol/

13、L組15μmol/L組ERmRNA的相對表達(dá)量分別為1.572±0.339、1.517±0.298，與對照組0.939±0.097相比有顯著性差異(P＜0.01)。20μmol/L組ERmRNA的相對表達(dá)量為0.918±0.116與對照組相比無顯著性差異。 結(jié)論：1蛇床子素及補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。 2蛇床子素及補(bǔ)骨脂素能提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。 3蛇床子素能提高成骨細(xì)胞骨鈣素的活性