殼聚糖-卵透明帶DNA口服避孕疫苗的研究.pdf

1、為探討卵透明帶DNA疫苗誘發(fā)輸卵管局部粘膜免疫以阻斷受精從而避免全身性免疫引起卵巢功能紊亂的可行性,本研究首先采用PCR法獲得了去除N端信號(hào)肽序列和C端跨膜區(qū)序列的豬卵透明帶ZP3 α(pZP3 α)的cDNA序列片段,以用于發(fā)展DNA疫苗的質(zhì)粒pVAX1為載體構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-pZP3 α。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將之導(dǎo)入HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外瞬時(shí)表達(dá),采用RT-PCR和間接免疫熒光技術(shù)(IIF)檢測(cè)到了pZP3 α在HeLa細(xì)胞

2、中的表達(dá)。然后,用殼聚糖C390包裹pVAX1-pZP3 α重組質(zhì)粒成功制備成納米微球,用原子力顯微鏡(AFM)觀察殼聚糖-DNA微球的形態(tài)結(jié)構(gòu),其直徑為100納米到300納米不等,平均為224.6nm,形狀為球形、橢圓形等,并且測(cè)定微球?qū)χ亟M質(zhì)粒DNA的包裹率達(dá)90%以上。將該微球體外轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,用IIF法檢測(cè)到了pZP3 α的表達(dá)。接著,以灌胃方式將這些DNA疫苗微球喂食小鼠,喂食五天后通過RT-PCR和IIF檢測(cè)到了此DNA

3、疫苗在小鼠小腸粘膜層細(xì)胞中的表達(dá)。殼聚糖/pVAX1-pZP3 α微球口服免疫小鼠后可以激發(fā)抗ZP3 IgA抗體反應(yīng),在免疫后第二周小鼠血清中出現(xiàn)明顯的抗體反應(yīng),在第四周抗體滴度開始迅速升高,在第10-11周滴度達(dá)到最高值,隨后又開始下降。較高水平的抗體大概可以維持6-7周。在陰道分泌物中也能檢測(cè)到抗ZP3 IgA抗體反應(yīng)?？股龑?shí)驗(yàn)顯示避孕率為50%,而且這種抗生育作用與交配時(shí)的抗ZP3 IgA抗體滴度有關(guān)。小鼠的卵巢切片觀察表明免疫