解偶聯(lián)蛋白2對高游離脂肪酸所致的胰島α細胞分泌功能異常的影響及其機理探討.pdf

1、第一部分：解偶聯(lián)蛋白2在高游離脂肪酸所致的胰島α細胞分泌功能異常中的作用
　　 目的：探討高游離脂肪酸（FFA）對體外培養(yǎng)的胰島α細胞胰高糖素分泌功能變化及抑制解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）表達對胰高糖素分泌功能的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細胞系TC1-6細胞，分別應用正常培養(yǎng)基、加用棕櫚酸和/或UCP2抑制劑genipin進行培養(yǎng)，測定比較各組胰高糖素分泌、細胞胰高糖素含量及胰高糖素mRNA表達。采用RNA干擾技術，

2、以特異性siRNA抑制UCP2表達，分別測定正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸和/或抑制UCP2表達后各組胰高糖素分泌、細胞胰高糖素含量及胰高糖素表達情況。
　　 結果：1.棕櫚酸培養(yǎng)刺激TC1-6細胞胰高糖素分泌顯著增加，而在此基礎上應用genipin或si-UCP2抑制UCP2，可使增加的胰高糖素水平下降。2.棕櫚酸培養(yǎng)并應用genipin或si-UCP2對TC1-6細胞胰高糖素含量及mRNA表達無明顯影響。3.正常培養(yǎng)的TC1-6細胞，

3、應用siRNA抑制UCP2表達后胰高糖素分泌也明顯降低，提示UCP2也參與正常α細胞分泌功能維持。
　　 結論：UCP2參與高水平FFA所致的胰島α細胞異常分泌，但不影響胰高糖素合成。UCP2對維持正常α細胞分泌功能也有一定作用。
　　 第二部分：解偶聯(lián)蛋白2調節(jié)的氧化應激在高游離脂肪酸所致的α細胞分泌功能異常中的作用
　　 目的：了解高FFA體外培養(yǎng)的胰島α細胞氧化應激狀態(tài)、細胞內Ca2+水平，及UCP2對其影

4、響。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細胞系TC1-6細胞，分別應用正常培養(yǎng)基、棕櫚酸及genipin或si-UCP2進行培養(yǎng)，采用實時定量PCR和western blot測定UCP2及對其表達有調控作用的過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α（PGC-1α）mRNA和蛋白水平表達。采用ELISA方法測定各組培養(yǎng)基上清液硝基酪氨酸（NT）水平。熒光標記細胞內Ca2+，流式細胞儀分別測定正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸及抑制UCP2表達并應

5、用棕櫚酸培養(yǎng)細胞平均熒光強度（MFI），以反映細胞內Ca2+水平。
　　 結果：1.棕櫚酸刺激UCP2表達，genipin抑制UCP2水平，而si-UCP2能夠更有效抑制UCP2表達，棕櫚酸對抑制后的UCP2仍有刺激作用，抑制后未達正常培養(yǎng)抑制后的低水平。2.棕櫚酸刺激PGC-1α水平上升，genipin能夠在一定程度抑制其表達，應用siRNA抑制UCP2對PGC-1α表達影響不大。3.加用棕櫚酸培養(yǎng)使NT水平上升，genipi

6、n對其影響不大，siRNA抑制UCP2表達后加用棕櫚酸NT水平進一步升高，提示UCP2參與氧化應激狀態(tài)的調節(jié)。4.短期應用棕櫚酸使熒光標記的細胞內Ca2+水平上升，抑制UCP2表達后加用棕櫚酸細胞內Ca2+水平低于前者。
　　 結論：高FFA刺激α細胞氧化應激水平增強，UCP2參與調控氧化應激，但在對α細胞功能影響過程中，其對氧化應激的抑制作用不是主要方面。FFA和UCP2對細胞內Ca2+濃度的影響可能與其影響α細胞分泌有關。<

7、br>　　 第三部分：解偶聯(lián)蛋白2對胰島α細胞胰島素信號通路的影響
　　 目的：探討高FFA對體外培養(yǎng)的胰島α細胞胰島素信號通路的影響及UCP2在其中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細胞系TC1-6細胞，測定分別正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸及si-UCP2培養(yǎng)后胰島素誘導的IRS-1磷酸化水平。在有無棕櫚酸背景分別加入胰島素、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）抑制劑wortmannin及genipin，測定各組的胰高糖素分泌

8、情況。并用western blotting檢測各組胰島素信號轉導下游分子Akt的磷酸化情況。
　　 結果：1.胰島素誘導IRS-1磷酸化，但與正常培養(yǎng)相比棕櫚酸組IRS-1磷酸化明顯受到抑制，而在棕櫚酸加si-UCP2組其抑制作用有所減弱。2.胰高糖素分泌結果顯示，應用棕櫚酸組胰高糖素分泌普遍高于未加棕櫚酸培養(yǎng)組，在未加棕櫚酸的各個亞組中，應用胰島素明顯抑制胰高糖素分泌，而加用wortmannin減弱該作用；genipin組胰高

9、糖素分泌略低于正常，而同時應用胰島素和/或wortmannin無明顯差別；在加用棕櫚酸的各亞組，應用胰島素對胰高糖素分泌有抑制，但未達顯著差異，在此基礎上應用wortmannin，能夠阻斷胰島素作用。3.胰島素誘導Akt磷酸化結果顯示，應用胰島素的亞組Akt磷酸化水平普遍高于未用胰島素的亞組；wortmannin能夠阻斷胰島素作用，在胰島素的基礎上再給予wortmannin，胰島素誘導的Akt磷酸化水平下降；應用棕櫚酸組胰島素誘導的Ak

10、t磷酸化升高水平低于未用棕櫚酸組，且應用wortmannin后棕櫚酸組對胰島素誘導的Akt磷酸化抑制率低于無棕櫚酸組，提示FFA對Akt磷酸化有抑制作用；在棕櫚酸基礎上加用genipin，可在一定程度上減輕FFA對胰島素誘導的Akt磷酸化的抑制作用，提示UCP2對PI3-K通路有一定抑制作用，并可能參與了FFA的抑制作用。
　　 結論：FFA抑制IRS-1及Akt磷酸化，抑制UCP2對FFA所致的胰島素信號通路轉導障礙有所改善，