解偶聯(lián)蛋白2對(duì)高游離脂肪酸所致的胰島α細(xì)胞分泌功能異常的影響及其機(jī)理探討.pdf

1、第一部分：解偶聯(lián)蛋白2在高游離脂肪酸所致的胰島α細(xì)胞分泌功能異常中的作用
　　 目的：探討高游離脂肪酸（FFA）對(duì)體外培養(yǎng)的胰島α細(xì)胞胰高糖素分泌功能變化及抑制解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）表達(dá)對(duì)胰高糖素分泌功能的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細(xì)胞系TC1-6細(xì)胞，分別應(yīng)用正常培養(yǎng)基、加用棕櫚酸和/或UCP2抑制劑genipin進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定比較各組胰高糖素分泌、細(xì)胞胰高糖素含量及胰高糖素mRNA表達(dá)。采用RNA干擾技術(shù)，

2、以特異性siRNA抑制UCP2表達(dá)，分別測(cè)定正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸和/或抑制UCP2表達(dá)后各組胰高糖素分泌、細(xì)胞胰高糖素含量及胰高糖素表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1.棕櫚酸培養(yǎng)刺激TC1-6細(xì)胞胰高糖素分泌顯著增加，而在此基礎(chǔ)上應(yīng)用genipin或si-UCP2抑制UCP2，可使增加的胰高糖素水平下降。2.棕櫚酸培養(yǎng)并應(yīng)用genipin或si-UCP2對(duì)TC1-6細(xì)胞胰高糖素含量及mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。3.正常培養(yǎng)的TC1-6細(xì)胞，

3、應(yīng)用siRNA抑制UCP2表達(dá)后胰高糖素分泌也明顯降低，提示UCP2也參與正常α細(xì)胞分泌功能維持。
　　 結(jié)論：UCP2參與高水平FFA所致的胰島α細(xì)胞異常分泌，但不影響胰高糖素合成。UCP2對(duì)維持正常α細(xì)胞分泌功能也有一定作用。
　　 第二部分：解偶聯(lián)蛋白2調(diào)節(jié)的氧化應(yīng)激在高游離脂肪酸所致的α細(xì)胞分泌功能異常中的作用
　　 目的：了解高FFA體外培養(yǎng)的胰島α細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，及UCP2對(duì)其影

4、響。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細(xì)胞系TC1-6細(xì)胞，分別應(yīng)用正常培養(yǎng)基、棕櫚酸及genipin或si-UCP2進(jìn)行培養(yǎng)，采用實(shí)時(shí)定量PCR和western blot測(cè)定UCP2及對(duì)其表達(dá)有調(diào)控作用的過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α（PGC-1α）mRNA和蛋白水平表達(dá)。采用ELISA方法測(cè)定各組培養(yǎng)基上清液硝基酪氨酸（NT）水平。熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，流式細(xì)胞儀分別測(cè)定正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸及抑制UCP2表達(dá)并應(yīng)

5、用棕櫚酸培養(yǎng)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（MFI），以反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。
　　 結(jié)果：1.棕櫚酸刺激UCP2表達(dá)，genipin抑制UCP2水平，而si-UCP2能夠更有效抑制UCP2表達(dá)，棕櫚酸對(duì)抑制后的UCP2仍有刺激作用，抑制后未達(dá)正常培養(yǎng)抑制后的低水平。2.棕櫚酸刺激PGC-1α水平上升，genipin能夠在一定程度抑制其表達(dá)，應(yīng)用siRNA抑制UCP2對(duì)PGC-1α表達(dá)影響不大。3.加用棕櫚酸培養(yǎng)使NT水平上升，genipi

6、n對(duì)其影響不大，siRNA抑制UCP2表達(dá)后加用棕櫚酸NT水平進(jìn)一步升高，提示UCP2參與氧化應(yīng)激狀態(tài)的調(diào)節(jié)。4.短期應(yīng)用棕櫚酸使熒光標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上升，抑制UCP2表達(dá)后加用棕櫚酸細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平低于前者。
　　 結(jié)論：高FFA刺激α細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，UCP2參與調(diào)控氧化應(yīng)激，但在對(duì)α細(xì)胞功能影響過(guò)程中，其對(duì)氧化應(yīng)激的抑制作用不是主要方面。FFA和UCP2對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響可能與其影響α細(xì)胞分泌有關(guān)。<

7、br>　　 第三部分：解偶聯(lián)蛋白2對(duì)胰島α細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響
　　 目的：探討高FFA對(duì)體外培養(yǎng)的胰島α細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響及UCP2在其中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)胰島α細(xì)胞系TC1-6細(xì)胞，測(cè)定分別正常培養(yǎng)、加用棕櫚酸及si-UCP2培養(yǎng)后胰島素誘導(dǎo)的IRS-1磷酸化水平。在有無(wú)棕櫚酸背景分別加入胰島素、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）抑制劑wortmannin及genipin，測(cè)定各組的胰高糖素分泌

8、情況。并用western blotting檢測(cè)各組胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游分子Akt的磷酸化情況。
　　 結(jié)果：1.胰島素誘導(dǎo)IRS-1磷酸化，但與正常培養(yǎng)相比棕櫚酸組IRS-1磷酸化明顯受到抑制，而在棕櫚酸加si-UCP2組其抑制作用有所減弱。2.胰高糖素分泌結(jié)果顯示，應(yīng)用棕櫚酸組胰高糖素分泌普遍高于未加棕櫚酸培養(yǎng)組，在未加棕櫚酸的各個(gè)亞組中，應(yīng)用胰島素明顯抑制胰高糖素分泌，而加用wortmannin減弱該作用；genipin組胰高

9、糖素分泌略低于正常，而同時(shí)應(yīng)用胰島素和/或wortmannin無(wú)明顯差別；在加用棕櫚酸的各亞組，應(yīng)用胰島素對(duì)胰高糖素分泌有抑制，但未達(dá)顯著差異，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用wortmannin，能夠阻斷胰島素作用。3.胰島素誘導(dǎo)Akt磷酸化結(jié)果顯示，應(yīng)用胰島素的亞組Akt磷酸化水平普遍高于未用胰島素的亞組；wortmannin能夠阻斷胰島素作用，在胰島素的基礎(chǔ)上再給予wortmannin，胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平下降；應(yīng)用棕櫚酸組胰島素誘導(dǎo)的Ak

10、t磷酸化升高水平低于未用棕櫚酸組，且應(yīng)用wortmannin后棕櫚酸組對(duì)胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化抑制率低于無(wú)棕櫚酸組，提示FFA對(duì)Akt磷酸化有抑制作用；在棕櫚酸基礎(chǔ)上加用genipin，可在一定程度上減輕FFA對(duì)胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化的抑制作用，提示UCP2對(duì)PI3-K通路有一定抑制作用，并可能參與了FFA的抑制作用。
　　 結(jié)論：FFA抑制IRS-1及Akt磷酸化，抑制UCP2對(duì)FFA所致的胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙有所改善，