晚期糖化終產(chǎn)物受體介導β-淀粉樣蛋白損傷血腦屏障的機制及銀杏葉提取物對其干預研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病，是癡呆的最常見類型。β-淀粉樣蛋白（amyloidβ peptide，Aβ）沉積在腦實質(zhì)引起CNS損傷是AD的特征性病理改變。越來越多的研究表明，除引起CNS損傷外，Aβ沉積在腦微血管壁引起內(nèi)皮細胞損傷、血腦屏障（blood-brain barrier, B

2、BB）功能障礙也是AD的重要病理改變，然而AD中BBB損傷的機制尚不清楚。研究認為Aβ沉積在腦血管系統(tǒng)，破壞BBB結(jié)構(gòu)完整性，BBB屏障功能損傷及腦血流(cerebral blood flow, CBF)減少，腦組織氧和營養(yǎng)不足，腦內(nèi)毒性代謝產(chǎn)物堆積，從而加速AD病變進展。鑒于BBB在AD發(fā)病中的重要作用，本課題擬從BBB病變?nèi)胧?，研究Aβ?lián)p傷BBB的可能機制，并通過觀察銀杏葉提取物(extract ofginkgo biloba，EG

3、b)對該損傷途徑的干預影響，以期為探索AD的防治手段提供實驗依據(jù)。
　　BBB是機體的重要屏障之一，對維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證大腦正常功能極為重要。腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMEC)是BBB的基本骨架，具有區(qū)別于外周血管內(nèi)皮的獨有特征。在高度分化的神經(jīng)血管系統(tǒng)中，BMEC以其顯著的特異性在BBB屏障特性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能中發(fā)揮著重要作用。BBB屏障功能及其低滲性主要依

4、賴于內(nèi)皮間緊密連接(tightj unction，TJ)，后者是BBB屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎，在保持內(nèi)皮生理屏障和低通透性方面具有關(guān)鍵作用。因此各種原因引起的TJ破壞都將導致BBB損傷，繼而CNS內(nèi)環(huán)境紊亂，最終加速中樞病變進展。TJ主要由相關(guān)鉸鏈蛋白ZO（ZO-1、2、3）、Claudin(Claudin-1、3、5、12)、Occludin構(gòu)成。BBB結(jié)構(gòu)完整性與TJ正常組合開放及關(guān)閉有關(guān)，TJ蛋白表達減少或蛋白分布異常均能引起TJ

5、結(jié)構(gòu)改變，導致BBB結(jié)構(gòu)完整性破壞，BBB通透性增加。尸檢研究證實AD患者存在BBB結(jié)構(gòu)完整性受損，TJ蛋白水平顯著減少。在體動物及體外細胞研究也發(fā)現(xiàn)Aβ可引起TJ蛋白水平下降，BBB通透性增加。
　　晚期糖化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）是晚期糖化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)的一種特征性細胞表面

6、受體，屬于免疫球蛋白超家族成員。健康成人中，除在肺組織以外，RAGE僅有極微量表達。RAGE除與AGEs結(jié)合外，還能與高速泳動族盒蛋白-1(highmobility group box1，HMGB-1)、S100/鈣粒蛋白家族、Aβ等多種配體結(jié)合調(diào)節(jié)細胞生命活動。近年研究發(fā)現(xiàn)，在CNS，Aβ通過RAGE下游信號通路激活氧化應激、炎癥反應等損傷途徑，從而活化小膠質(zhì)細胞炎癥效應，損傷神經(jīng)元。Aβ-RAGE相互作用還能激活核因子-κB(nuc

7、lear factor-κB，NF-κB)，引起RAGE表達增加，從而激活Aβ介導的正反饋損傷效應。可見，腦內(nèi)RAGE表達上調(diào)與AD神經(jīng)元損傷相關(guān)。此外，BMEC上極微量表達的RAGE是參與BBB轉(zhuǎn)運Aβ的重要載體之一，其與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(LDH receptor related protein，LRP-1)協(xié)同維持腦內(nèi)Aβ正常水平。LRP-1將腦內(nèi)Aβ轉(zhuǎn)運至外周血液循環(huán)，繼而經(jīng)肝臟代謝清除，RAGE則將血液中Aβ轉(zhuǎn)運入腦

8、沉積。在AD中，LRP-1表達減少，RAGE含量顯著增加。然而，RAGE在AD BBB損傷中的作用仍不十分清楚。據(jù)此，本研究提出猜想，RAGE是否也與Aβ誘導BBB損傷過程有關(guān)，其相關(guān)調(diào)控機制如何？
　　研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與多種病變引起的BBB通透性增加有關(guān)，而抑制MMP活性能阻斷BBB損傷途徑。如腦卒中動物模型ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白

9、水平降低，敲除MMP-9能改善上述TJ蛋白水平。置于脈沖電磁場（pulsed electromagnetic field，PEMF）中的小鼠腦血管內(nèi)皮細胞MMP-2、MMP-9表達增加，ZO-1水平明顯減少，BBB通透性增加，而抑制MMP-2、MMP-9活性可阻斷PEMF引起的BBB損傷。據(jù)此我們推測，AD中BBB損傷可能與Aβ誘導MMP表達有關(guān)，后者通過酶降解作用引起TJ蛋白含量減少，引起TJ正常結(jié)構(gòu)破壞及BBB通透性增加。
　

10、　因此，本課題采用小鼠BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細胞模型，觀察Aβ1-42對BBB的影響并探討RAGE在Aβ1-42介導BBB損傷中的作用及其可能機制，同時觀察EGb對Aβ1-42誘導BBB損傷的干預作用。
　　本課題主要結(jié)果如下:
　　(一)RAGE介導Aβ1-42損傷BBB的機制研究
　　1.Aβ1-42誘導BMEC細胞損傷
　　Aβ1-42誘導BMEC細胞損傷:MTT結(jié)果顯示Aβ1-42降低BMEC細胞活

11、力。三種形態(tài)Aβ1-42中，Aβ1-42單體(Aβ1-42-monomer, Aβ1-42-Mono)、寡聚態(tài)Aβ1-42(Aβ1-42-oligomer，Aβ1-42-Oligo)及纖維狀Aβ1-42(Aβ1-42-fibrils，Aβ1-42-Fibril)均能降低BMEC細胞活力。Aβ1-42-Oligo細胞毒性較Aβ1-42-Mono與Aβ1-42-Fibril顯著，Aβ1-42-Oligo呈時間依賴性和濃度依賴性誘導BMEC細

12、胞活力下降。
　　2.Aβ1-42誘導BBB細胞模型通透性增加
　　Aβ1-42誘導BBB模型通透性增加:通過BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細胞模式，檢測熒光素鈉(sodium fluorescein，Na-F，MW:376 Da)吸光值分析BBB細胞模型通透性變化，結(jié)果顯示三種成分Aβ1-42均可誘導BBB模型通透性增加，Aβ1-42-Mono組Na-F吸光值為對照組的4.3倍，Aβ1-42-Oligo組Na-F吸光值為對照

13、組的8.2倍，Aβ1-42-Fibril組Na-F吸光值為對照組的1.7倍;Aβ1-42-Oligo呈時間依賴性和濃度依賴性誘導單細胞層BBB模型通透性增加。
　　3.Aβ1-42誘導TJ蛋白水平下降
　　(二）EGb干預Aβ1-42-Oligo誘導BBB損傷的研究
　　1.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導BMEC細胞損傷EGb改善BMEC細胞活力:通過MTT檢測細胞活力，結(jié)果顯示，EGb濃度依賴性抑制Aβ1-4

14、2-Oligo引起的BMEC細胞活力的降低，EGb濃度為100μg/ml時BMEC細胞活力為對照組的97.01％，EGb濃度200μg/ml時BMEC細胞活力為對照組的95.13％。
　　2.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導BMEC細胞凋亡
　　EGb抑制細胞凋亡發(fā)生:Hoechst-33258染色顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導的細胞凋亡發(fā)生，降低Aβ1-42-Oligo引起的BMEC細胞凋亡比例。

15、　　3.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導BMEC細胞內(nèi)ROS生成
　　EGb抑制細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成:H2DCF-DA熒光染色檢測細胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導的BMEC胞內(nèi)ROS生成。
　　結(jié)論:
　　1) Aβ能引起B(yǎng)BB細胞模型通透性增加，Aβ-Oligo可能是AD中引起該損傷效應的主要Aβ成分。
　　2) RAG

16、E是介導Aβ?lián)p傷BBB的重要環(huán)節(jié)，Aβ-RAGE相互作用引起TJ蛋白損傷，BBB細胞模型通透性增加，其機制與誘導BMEC損傷及上調(diào)MMP-2、MMP-9及RAGE自身表達增加相關(guān)。
　　3) EGb對Aβ誘導BBB損傷具有保護作用，能保護TJ蛋白，降低BBB細胞模型通透性，其機制與抑制Aβ毒性誘導BMEC損傷及抑制RAGE表達相關(guān)。
　　通過比較三種不同成分Aβ對BBB的影響，本研究首次闡述Aβ1-42-Oligo可能是AD