晚期糖化終產(chǎn)物受體在炎癥性血管損傷中的作用.pdf

1、已有研究資料表明炎癥性血管損傷是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(CVD)和2型糖尿病的共同病理過程，但是炎癥性血管損傷的機(jī)制至今仍不十分清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)與炎癥性血管損傷有關(guān)，本研究應(yīng)用反義RNA和基因芯片等技術(shù)進(jìn)一步探討RAGE在炎癥性血管損傷中的作用及其機(jī)制，尋找與RAGE作用相關(guān)的基因，為防治炎癥性血管損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 一、糖尿病人外周血單核細(xì)胞RAGE的表達(dá)及其與血清炎癥因子的關(guān)系

2、 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)糖尿病患者外周血單核細(xì)胞RAGE蛋白的表達(dá)，分析RAGE水平與血清炎癥因子的關(guān)系。結(jié)果顯示2型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞RAGE的蛋白表達(dá)率為54.7％±8.9％，較正常對(duì)照組明顯增加。直線相關(guān)分析顯示RAGE蛋白表達(dá)率與TNF-α和IL-6呈正相關(guān)。多元逐步回歸分析示TNF-α和糖基化血紅蛋白為影響：RAGE蛋白表達(dá)率的顯著因素。 二、RAGE、PDGF-β在SD大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜中的表達(dá)

3、 建立SD大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，檢測(cè)RAGE、PDGF-β在頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜中的表達(dá)，并應(yīng)用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的大鼠RAGE反義RNA局部處理觀察RAGE在炎癥性血管損傷中的作用。結(jié)果顯示大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后14 d后新生內(nèi)膜組織中RAGE、PDGF-β表達(dá)明顯增強(qiáng)。成功構(gòu)建了大鼠RAGE反義RNA腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，并獲得8.7×10<'7>個(gè)病毒顆粒/mL的病毒原液。應(yīng)用體外動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在感染RAGE反義RNA腺相關(guān)病

4、毒的頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜中RAGE的表達(dá)下降，同時(shí)PDGF-β的表達(dá)也下降。 三、RAGE的表達(dá)水平對(duì)ECV304細(xì)胞分泌炎癥因子功能的影響 應(yīng)用FCM和RT-PCR檢測(cè)晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)ECV304細(xì)胞RAGE表達(dá)的影響，結(jié)果顯示不同濃度的AGEs作用ECV304細(xì)胞24 h，RAGE的mRNA和蛋白表達(dá)較未刺激前明顯增加。應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建人RAGE反義RNA真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入ECV304細(xì)胞

5、，經(jīng)抗性基因篩選陽性克隆，F(xiàn)CM鑒定，建立低表達(dá)RAGE的ECV304細(xì)胞克隆。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA的細(xì)胞克隆中RAGE表達(dá)被抑制58.2％±7.1％。RAGE反義RNA減輕AGEs刺激ECV304細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6。 四、轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA對(duì)ECV304細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響 應(yīng)用Affymetrix公司生產(chǎn)的人類基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA對(duì)ECV304細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，并驗(yàn)證部

6、分基因芯片結(jié)果。結(jié)果顯示在RAGE高表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)達(dá)2倍的有245個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)達(dá)2倍的有186個(gè)基因。結(jié)合生物學(xué)功能分析顯示RAGE的下游基因中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因如整合素β1(ITGB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、凝血酶敏感蛋白-1(THBS1)、前列腺素G/H合成酶即環(huán)氧化酶(PTGS2)等明顯上調(diào)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的信號(hào)分子，如磷脂酶Cβ1(PLCβ1)、磷脂酶Cβ4(PLCβ4)、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ(CAMK Ⅳ

7、)等基因明顯上調(diào)?；蛐酒Y(jié)果顯示多種轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)上調(diào)及許多變化顯著的未知功能基因、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。 五、磷脂酶C、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ在RAGE胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用 在基因芯片研究基礎(chǔ)上，利用磷脂酶C(PLC)抑制劑研究PLC在AGEs-RAGE通路引起ECV304細(xì)胞胞漿游離鈣濃度改變中的作用，結(jié)果顯示PLC抑制劑抑制RAGE介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>增加。構(gòu)建顯性負(fù)突變的CAMK Ⅳ(DN-C