Tim-3和PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)和作用研究.pdf

1、研究背景:
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是造成人類喪失勞動力和致殘的主要疾病之一，具有慢性、進(jìn)行性、侵襲性的特點;因此，早期診斷和治療至關(guān)重要。已有研究證實，人體免疫系統(tǒng)失衡造成的T細(xì)胞功能失調(diào)不僅是RA的發(fā)病原因之一，而且在RA患者不同的預(yù)后、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著不容忽視、甚至是決定性的作用。但在RA患者中免疫系統(tǒng)對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用機制尚不明確。
　　眾多研究表明，多種免疫調(diào)節(jié)因子在RA中的

2、T細(xì)胞功能失調(diào)中發(fā)揮著重要作用。Tim-3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3，Tim-3)與PD-1（programmed death-1）是影響T細(xì)胞功能的重要免疫調(diào)節(jié)因子。Tim-3是在2002年被發(fā)現(xiàn)的，特異性表達(dá)在分化終末期的Th1細(xì)胞上的新型免疫調(diào)節(jié)分子。Tim-3與其配體之一galectin-9相互作用可負(fù)向調(diào)控干擾素gamma的產(chǎn)生，并

3、可影響T細(xì)胞耐受的形成。PD-1主要表達(dá)在激活后的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，并通過召集SHP-2到磷酸化后的半胱氨酸來抑制免疫反應(yīng)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3和PD-1在小鼠自身免疫疾病中對T細(xì)胞具有抑制作用，提示其在RA中很有可能具有調(diào)節(jié)并抑制T細(xì)胞過激的免疫反應(yīng)并緩解炎癥的作用。本課題利用臨床研究和體外細(xì)胞實驗研究Tim-3和PD-1在RA發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)及功能，為進(jìn)一步深入闡明RA相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)，并為開拓新的治

4、療方法提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達(dá)與RA疾病進(jìn)展的關(guān)系
　　1.1、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)
　　收集不同嚴(yán)重程度的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者的新鮮外周抗凝血，流式細(xì)胞術(shù)檢測Tim-3在外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　1.2、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)
　　收集不

5、同嚴(yán)重程度的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的新鮮關(guān)節(jié)滑液，流式細(xì)胞術(shù)檢測Tim-3在滑液CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　1.3、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)與DAS28評分的相關(guān)性的研究
　　對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外周血不同T細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá)與患者DAS28評分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。
　　1.4、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)與DAS28評分的相

6、關(guān)性的研究
　　對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液不同T細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá)與患者DAS28評分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。
　　2.Tim-3對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者T細(xì)胞功能影響的研究
　　2.1、Tim-3對T細(xì)胞增殖功能的研究
　　收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者的新鮮外周抗凝血，利用陰性選擇試劑盒分離出外周血T細(xì)胞，加入Tim-3封閉抗體或同型對照抗體后培育6天，利用CFSE染色分別檢測CD4+T細(xì)胞和CD

7、8+T細(xì)胞的增殖情況。
　　2.2、Tim-3對T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌功能的研究
　　收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者的新鮮外周抗凝血，利用陰性選擇試劑盒分離出外周血T細(xì)胞，加入Tim-3封閉抗體或同型對照抗體后分別檢測CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ和TNF-α的分泌情況。
　　3.PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達(dá)與RA疾病進(jìn)展關(guān)系以及機制
　　3.1、PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血不同T細(xì)胞

8、亞群中的表達(dá)
　　收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者的新鮮外周抗凝血，流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-1在外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.2、PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)與CRP指標(biāo)的相關(guān)性的研究
　　對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外周血不同T細(xì)胞亞群上PD-1的表達(dá)與患者CRP指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。
　　3.3、PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)與DA

9、S28評分的相關(guān)性的研究
　　對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外周血不同T細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá)與患者DAS28評分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。
　　3.4、PD-1對T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子分泌功能的研究
　　收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者的新鮮外周抗凝血，利用陰性選擇試劑盒分離出外周血T細(xì)胞，加入PD-1封閉抗體或同型對照抗體后培育6天，利用CFSE染色分別檢測CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖情況?；驒z測CD4+T細(xì)胞

10、和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ和TNF-α的分泌情況。
　　4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Student's t檢驗、Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗、Pearson相關(guān)性分析。p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的T細(xì)胞中表達(dá)升高，并與疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)
　　1.1、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血T細(xì)胞的表達(dá)升高
　　流

11、式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)均顯著高于健康志愿者對照(p＜0.01)，表明Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中全身性免疫系統(tǒng)表達(dá)升高。
　　1.2、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液T細(xì)胞的表達(dá)升高
　　為了更清楚地研究Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達(dá)，我們收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Tim-3在關(guān)節(jié)滑液T細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果顯示

12、，患者的關(guān)節(jié)滑液CD4+T細(xì)胞的Tim-3表達(dá)不僅明顯高于健康對照(p＜0.001)，而且明顯高于患者外周血CD4+T細(xì)胞的Tim-3表達(dá)(p＜0.01)。同樣，患者的關(guān)節(jié)滑液CD8+T細(xì)胞的Tim-3表達(dá)不僅明顯高于健康對照(p＜0.001)，而且明顯高于患者外周血CD8+T細(xì)胞的Tim-3表達(dá)(p＜0.01)。結(jié)果進(jìn)一步表明Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的局部免疫系統(tǒng)表達(dá)升高，并表示其可能在炎癥產(chǎn)生和發(fā)展中的作用。
　　1.3、

13、Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達(dá)與DAS28評分負(fù)相關(guān)
　　統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+T細(xì)胞、外周血CD8+T細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液CD4+T細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑液CD8+T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平均與患者DAS28評分呈負(fù)相關(guān)(分別為p=0.009，p＜0.001，p=0.002，p=0.006)，提示Tim-3很可能對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞具有抑制作用，并通過抑制T細(xì)胞的功能緩解類

14、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)展。
　　2.Tim-3對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者T細(xì)胞的功能具有抑制作用
　　2.1、Tim-3對T細(xì)胞增殖功能具有抑制作用
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞與Tim-3封閉抗體共同培育6天后增殖情況明顯高于與同性對照抗體共同培育的CD4+T細(xì)胞(p＜0.05)。同理，CD8+T細(xì)胞與Tim-3封閉抗體共同培育6天后增殖情況明顯高于與同性對照抗體共同培育的CD8+T細(xì)胞(p＜0.01)。表明T

15、im-3對T細(xì)胞增殖功能具有抑制作用。
　　2.2、Tim-3對T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌功能具有抑制作用
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞與Tim-3封閉抗體共同培育后IFN-γ和TNF-α分泌情況明顯高于與同性對照抗體共同培育的CD4+T細(xì)胞（分別為p＜0.05，p＜0.01）。同時CD8+T細(xì)胞與Tim-3封閉抗體共同培育后IFN-γ和TNF-α分泌情況也明顯高于與同性對照抗體共同培育的CD8+T細(xì)胞（分別為p＜0.

16、05，p＜0.05）。表明Tim-3對T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能具有抑制作用。
　　3.PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的T細(xì)胞中表達(dá)降低，并與疾病進(jìn)展相關(guān)
　　3.1、PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血T細(xì)胞和血清中的表達(dá)降低
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)均顯著低于健康志愿者對照(分別為p=0.002和p＜0.001)。血清檢測發(fā)現(xiàn)PD-1在患者血

17、清中的含量與健康對照相比有明顯降低(p＜0.05)。
　　3.2、PD-1與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者CRP結(jié)果呈負(fù)相關(guān)
　　統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CRP結(jié)果呈陽性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)明顯低于CRP結(jié)果呈陰性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(p＜0.001)。同樣，CRP結(jié)果呈陽性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)明顯低于CRP結(jié)果呈陰性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(p＜0.001)。此結(jié)果提示PD-1表

18、達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者CRP值相關(guān)聯(lián)，并有可能作為檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)展的指標(biāo)之一。
　　3.3、PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達(dá)與DAS28評分負(fù)相關(guān)
　　統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+T細(xì)胞和外周血CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)均與患者DAS28評分呈負(fù)相關(guān)(分別為p＜0.001，p=0.001)，提示PD-1可能參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)展，并可以用作為描述類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展的指標(biāo)之一

19、。
　　3.4、PD-1封閉抗體對T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌無作用
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞與PD-1封閉抗體共同培育6天后增殖情況并無明顯改變。而CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞與PD-1封閉抗體共同培育后IFN-γ,和TNF-α分泌情況亦無明顯變化。表明PD-1封閉抗體對外周T細(xì)胞并不產(chǎn)生明顯功效。
　　結(jié)論:
　　(1)Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的T細(xì)胞中表達(dá)升高，并與

20、疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。
　　(2)Tim-3對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者T細(xì)胞的功能，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ和TNF-0α分泌，以及CD8+T細(xì)胞的殺傷功能具有抑制作用。
　　(3)PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的T細(xì)胞中表達(dá)降低，并與疾病進(jìn)展相關(guān)。
　　創(chuàng)新點及意義:
　　本研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血和關(guān)節(jié)滑液T細(xì)胞（包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）上

21、Tim-3表達(dá)顯著升高，并利用統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)Tim-3表達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，首次提出了Tim-3與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展的聯(lián)系。
　　本研究利用類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血T細(xì)胞和Tim-3封閉抗體，證實Tim-3對患者內(nèi)T細(xì)胞炎癥具有抑制作用，首次提示有可能通過增強Tim-3功能來減弱類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的自身免疫反應(yīng)，作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的新靶點，并首次檢驗了Tim-3封閉抗體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)能否有效阻截Ti