缺氧誘導因子1對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、缺氧誘導因子1(HIF-1)是細胞在缺氧條件上下產(chǎn)生的核蛋白，由α和β亞基組成。在缺氧條件下，細胞核產(chǎn)生HIF-1與靶基因結合，促進該基因轉錄，引起細胞對缺氧的一系列反應，在促進紅細胞生成，血管生成，調節(jié)血管及促進糖酵解方面有重要作用。缺氧誘導因子1在缺氧條件下對心肌細胞同樣發(fā)揮重要作用。 缺血預適應(IP)作為心臟通過反復短暫的心肌缺血/再灌注而產(chǎn)生的一種自我保護機制，可以使HIF-1α的表達增加，對心肌細胞具有保護作用。鑒于

2、缺血時HIF-1α的表達是引發(fā)各種缺氧應激蛋白表達的轉錄因子，在缺血的適應性反應中起核心作用，被認為是內源性保護機制的始動因子和共同途徑，因而可以設想缺血預處理可能是通過HIF-1α表達及其促進下游相關基因的轉錄和表達來發(fā)揮保護效應的。缺氧誘導因子1對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的作用以及信號傳導通路尚不十分清楚?；诖耍覀冄芯苛薍IF-1α對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的作用以及PKC的信號傳導作用，分為三個部分。 第一部分 心肌內

3、注射HIF-1α進行基因轉染對大鼠心肌梗死的影響 目的：缺氧誘導因子(HIF-1)是細胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核蛋白。由α和β亞基組成。在缺氧條件下，細胞核產(chǎn)生HIF-1與靶基因結合，促進該基因轉錄，引起細胞對缺氧的一系列反應，在促進紅細胞生成，血管生成，調節(jié)血管及促進糖酵解方面有重要作用。缺氧誘導因子1在缺氧條件下對心肌細胞同樣發(fā)揮重要作用。 缺血預處理(IP)可以使HIF-1α的表達增加，對心肌細胞具有保護作用。但轉染H

4、IF-1α是否對心肌梗死具有保護作用尚不十分清楚，本實驗將對急性心．肌梗死模型大鼠進行心肌內注射HIF-1α,觀察HIF-1α對心肌梗死有何影響。 材料與方法：體重250-350克的雄性WiSta大鼠72只，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物部提供。將實驗分為三組，第一組為轉染腺病毒HIF-1α的Ad-HIF-1α組：第二組為轉染空質粒的Ad-null組(轉染空質粒組)；第三組為假手術組；每組以術后的不同時間處死取材分3天，7天，1

5、4天三個亞組，每個亞組8只。采用文獻方法建立心肌梗死模型。Ad-HIF-1α組Ad-null組在左室游離壁的三個不同部位分別注射50μg的Ad-HIF-1α和50μg的Ad-dull，然后關胸縫合。假手術組不結扎左前降支。轉染3天、7天及14天后，10％/水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)原切口下一肋間開胸，觀察心臟活動形態(tài)后活體取出心臟，迅速取材，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片

6、，石蠟包埋切片，HE染色行形態(tài)學觀察，14天后測量心肌梗死面積；CD34-抗顯示毛細血管計算得毛細血管密度。逆轉錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表達，用VEGF試劑盒測定VEGF含量。 結論：心肌內注射腺病毒HIF-1α，能增加HIF-1α和VEGFmRNA的基因表達；使血中VEGF水平升高；心肌毛細血管密度明顯增加；使心肌梗死面積明顯減少，對急性心肌梗死具有明顯的保護作用。 第二

7、部分 目的：缺血預適應(IP)作為心臟通過反復短暫的心肌缺血/再灌注而產(chǎn)生的一種自我保護機制，對心臟的保護作用已為大家共識，Shiki等則在1987年首次證實預先5分鐘的冠狀動脈阻閉可明顯降低在體大鼠心臟持續(xù)缺血后再灌注心律失常的發(fā)生率。雖然IP現(xiàn)象已得到大家的共識，但其確切機制尚不完全明了，細胞內信號轉導途徑也未完全闡明。鑒于缺血時HIF-1α的表達是引發(fā)各種缺氧應激蛋白表達的轉錄因子，在缺血的適應性反應中起核心作用，被認為是

8、內源性保護機制的始動因子和共同途徑，因而可以設想缺血預處理可能是通過HIF-1α表達及其促進下游相關基因的轉錄和表達來發(fā)揮保護效應的。而蛋白激酶C(PKC)的信號傳導對缺血預適后急性心肌梗死HIF-1表達有何影響尚不十分清楚?；诖耍覀冄芯苛巳毖A適應后急性心肌梗死HIF-1表達有何變化及PKC的信號傳導作用。 材料與方法：體重250-350克的雄性Wista大鼠32只，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物部提供。將實驗分為四組，第

9、一組為缺血預適應組(IP組)；第二組為單純急性心肌梗死組(MI組)；第三組為缺血預適應加KPC抑制劑組(IP+I組)；第四組為假手術組(C組)。采用文獻方法建立心肌梗死模型。左前降支被結扎后建立心肌梗死模型，缺血預適應(IP)組結扎左前降支5分鐘后松開套管，反復三次，然后結扎左前降支；缺血預適應加KPC抑制劑組(IP+I組)預適應前10分鐘靜脈注射PKC抑制劑白屈菜季銨堿(chelerythrine 5mg/kg iv)，然后結扎左前降

10、支；假手術組?不結扎左前降支。1天后，10％/水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)原切口下一肋間開胸，觀察心臟活動形態(tài)后活體取出心臟，迅速取材，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片，石蠟包埋切片。HE染色進行形態(tài)學觀察，1天后測量心肌梗死面積。免疫組化染色(SP法)觀察HIF-1α表達，逆轉錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表達，蛋白質印記分析檢測H

11、IF-1α、VEGF的蛋白表達，術前術后用VEGF試劑盒測定VEGF含量。 結論： 1、缺血預適應能使HIF-1αmRNA表達明顯增加，其靶基因VEGFmRNA也明顯增加，其蛋白表達有相同的變化。 2.HIF-1α表達是缺血預適應重要的內源性保護機制。 3.HIF-1α的表達是依賴于PKC激活的，PKC是HIF-1α表達的重要信號傳導通路。 第三部分 目的：缺血-再灌注損傷(ischemi

12、a-reperfusion injury，IRI)是重要的臨床現(xiàn)象。使用氧自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑等對抗鈣離子超載和氧自由基的措施對IRI的療效令人失望。缺氧誘導因子(HIF-1α)是細胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核轉錄因子。最近的實驗表明，血紅素加氧酶(HO-1)可以抑制IRI，而HO-1編碼基因是HIF-1α重要的靶基因之一。二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)是脯氨酸羥化酶(Prolylhydroxylase)的抑制劑，可以顯

13、著地增強HIF-1a的活性。在缺血與再灌注損傷中，白細胞介素8(IL-8)是重要的損傷因子，其水平同缺血-再灌注損傷程度呈正相關。本實驗通過DMOG增強HIF-1α的活性，觀察HIF-1α活性與HO-1基因表達、IL-8水平的變化，探討HIF-1α對心肌缺血-再灌注損傷的影響。 材料與方法：選擇體重在250～350g的雄性大鼠32只(12-14周齡)進行實驗(實驗動物由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物室提供)。將實驗分為四組，每組8

14、只。第一組：為DMOG處理組，在缺血與再灌注損傷模型建立前24h進行腹腔內注射DMOG，劑量為20ug/g。第二組：為鹽水注射組(saline組)，在缺血與再灌注損傷模型建立前24h進行腹腔內注射生理鹽水0.5ml。第三組：為缺血預適應(IP)組；第四組對照組，即假手術組。采用文獻方法[4]建立缺血與再灌注損傷模型，打開前胸暴露心臟(參閱第一部分)，結扎左前降支(剛分出第一對角支處)，30分鐘后打開結扎，再灌注180分鐘后迅速取出心臟。

15、缺血預適應(IP)組結扎左前降支5分鐘后松開套管，反復三次，然后結扎左前降支30分鐘后打開結扎，再灌注180分鐘后迅速取出心臟，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片，石蠟包埋切片。假手術組(對照組)不 結扎左前降支。180分鐘后測量心肌梗死面積，逆轉錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、HO-1 mRNA表達，蛋白質印記分析測定HIF-1α、HO-1及

16、Caspase-3的蛋白表達的蛋白表達，再灌注60分、120分采用大鼠眶靜脈采血0.5ml，再灌注180分用大鼠心內采血，ELLSA試劑盒測定IL-8水平；MPO(髓過氧化物酶)試劑盒測定MPO水平。 結論：經(jīng)DMOG處理后，HIF-1αmRNA、HO-1mRNA表達明顯增多，心肌梗死面積明顯減少，Caspase-3的活性與IL-8的水平明顯降低，引起了類似延遲缺血預適應的現(xiàn)象，表明HIF-1α對心肌缺血與再灌注損傷具有重要保護