NOD樣受體在實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎大鼠腸道損傷中的作用.pdf

1、目的:
　　重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種持續(xù)高死亡率的嚴(yán)重的全身疾病。急性胰腺炎可引起腸粘膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙。腸道粘膜屏障受損會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增加，腸道細(xì)菌易位(bacterial translocation，BT)和內(nèi)毒血癥，以及釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，并引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome

2、，SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。與此同時(shí)，腸粘膜屏障損傷在急性胰腺炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用。急性胰腺炎引起腸道屏障損傷機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全清楚。
　　先天免疫系統(tǒng)是抵御微生物的第一道防線，最近的研究發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)家族-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide binding oligomerizationdomain，NOD)樣受體(NL

3、Rs)，可以識(shí)別、抵御微生物病原體，兼有調(diào)控共生菌群和腸道穩(wěn)態(tài)的作用。NOD樣受體是高度保守的胞內(nèi)模式識(shí)別受體。這些蛋白的結(jié)構(gòu)包括:(1)中央的核苷酸結(jié)合寡聚化區(qū)域(NACHT/NOD)，負(fù)責(zé)核苷酸的結(jié)合和自身寡聚化;(2)N末端效應(yīng)結(jié)合區(qū)域，即N-末端蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，如半胱氨酸蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(activation and recruitment domain，CARD)一個(gè)熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，P

4、YD)，負(fù)責(zé)下游接頭蛋白和效應(yīng)分子結(jié)合;(3)C末端富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)，負(fù)責(zé)識(shí)別微生物或內(nèi)源性信號(hào)。包含CARD的NOD蛋白NOD1和NOD2通過(guò)與包含CARD的激酶RIP2相互作用進(jìn)一步激活NF-κB、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon(IFN) regulatory facto

5、rs，IRFs)，可引起下游炎性細(xì)胞因子前體分泌，例如:IL-1，IL-6，IL-18，TNF-α和IFN。而包含PYD的NLRP蛋白與適配器蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）結(jié)合引起caspase-1的激活，加工炎性細(xì)胞因子。
　　NOD樣受體可能參與了急性胰腺炎及自身免疫性胰腺炎無(wú)菌炎癥反應(yīng)，但其在急性胰腺炎導(dǎo)致的腸道損傷中的作用，目

6、前未見(jiàn)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，觀察SAP時(shí)出現(xiàn)的胰腺、腸道組織學(xué)方面的變化，及NOD蛋白和mRNA在腸道的表達(dá)情況;同時(shí)探索caspase-1抑制劑對(duì)SAP時(shí)腸道NOD樣受體以及腸道損傷的影響。從分子水平闡明SAP腸損傷的發(fā)病機(jī)制，為SAP腸損傷的臨床治療提供一個(gè)新的思路。
　　方法:
　　1、將60只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)(S0)組、SAP模型+腹腔注射生理鹽水(SAP-S)組和SAP模型+

7、caspase-1抑制劑(SAP-ICE-I)組，每組再分為6h、12h2個(gè)亞組，每組各10只。
　　2、采用胰管內(nèi)逆行注射5％?；悄懰徕c的方法誘發(fā)動(dòng)物模型。SAP-S組于造模后2h腹腔注射生理鹽水1ml; SAP-ICE-I組于造模后2h腹腔注射ICE抑制劑0.25 mg（溶于1 ml PBS）。SO組模擬胰膽管穿刺操作，但不注射藥物。
　　3、分別于造模后6h、12h留取血、胰腺、腸道組織，檢測(cè)血清內(nèi)IL-1β、IL-1

8、8水平，留取標(biāo)本通過(guò)HE染色觀察胰腺、腸道的病理變化，采用RT-PCR、Western-blot的方法觀察比較三組腸道NOD1、NOD2、NLRP3蛋白及mRNA的表達(dá)差異，Western-blot檢測(cè)caspase-1蛋白變化。
　　4、所有數(shù)據(jù)采用（(x)±S）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。設(shè)α=0.05，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、HE染色觀察，SAP-S組

9、胰腺和腸道組織病理?yè)p傷程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步加重，與SAP-S組相比，SAP-ICE-I組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)胰腺及腸道病變程度有所減輕。
　　2、血清IL-18: SAP-S組(6 h48.8±12.2 pg/ml;12 h63.98±14.27pg/ml)與SO組(6 h21.74±9.50pg/ml;12 h22.4±9.16 pg/ml)各時(shí)間點(diǎn)比較，大鼠血清IL-18含量顯著升高(P＜0.01);SAP-ICE-I組(6 h32.90

10、±6.69 pg/ml;12 h33.29±10.99 pg/ml)與SO組相比，6h組IL-18含量升高(P＜0.05)，12h組IL-18含量無(wú)明顯差異;SAP-ICE-I組與SAP-S組相比顯著下降(P＜0.01);各組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間相比，SAP-S組12 h組高于6h組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、血清IL-1β: SAP-S組(6 h107.85±13.70 pg/ml;12 h126.77±15.23pg

11、/ml)與SO組(6 h61.26±13.61 pg/ml;70.83±15.71 pg/ml)各時(shí)間點(diǎn)比較，大鼠血清IL-1β含量顯著升高(P＜0.01);SAP-ICE-I組與SO組相比，含量升高(P＜0.05);SAP-ICE-1組(6 h78.51±10.67 pg/ml;12h87.58±16.61 pg/ml)與SAP-S組相比顯著下降（P＜0.01）;各組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間相比，SAP-S血清IL-1β含量12h組高于6h組(

12、P＜0.05)。
　　4、RT-PCR檢測(cè)NOD1 mRNA表達(dá)情況:SAP-S組和SAP-ICE-I組NOD1 mRNA的量較SO組均上升（分別P＜0.01;P＜0.05）; SAP-ICE-I組與SAP-S組相比mRNA的量下降(P＜0.05);SO組、SAP-ICE-I組NOD1 mRNA量6h、12h時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，SAP-S組6h、12h時(shí)間點(diǎn)相比，12 h mRNA的量高于6h，且有顯著差異(P＜

13、0.01)。
　　5、RT-PCR檢測(cè)NOD2 mRNA表達(dá)情況:SAP-S組NOD2 mRNA的量較SO組上升，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著差異（P＜0.05）;SAP-ICE-I組與SO組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);SAP-ICE-I組與SAP-S組比較NOD2mRNA的量下降，有顯著差異(P＜0.05);SO組、SAP-ICE-I組NOD1mRNA量6h、12h時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，SAP-S組6h、12h時(shí)間點(diǎn)

14、相比，12 h mRNA的量高于6h，且有顯著差異(P＜0.01)。
　　6、RT-PCR檢測(cè)NLRP3 mRNA表達(dá)情況:SAP-S組NLRP3 mRNA的量較SO組明顯上升，有顯著差異(P＜0.01);SAP-ICE-I組與SO組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05);SAP-ICE-I組NLRP3 mRNA的量較SAP-S組下降，有顯著差異(P＜0.01);SO組、SAP-ICE-I組NOD1 mRNA量6h、12h時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著

15、差異（P＞0.05），SAP-S組6h、12h時(shí)間點(diǎn)相比，6 h mRNA的量高于12h，且有顯著差異(P＜0.01)。
　　7、Western blot檢測(cè)NOD1蛋白表達(dá)情況:SAP-S組與SO組NOD1蛋白量各時(shí)間點(diǎn)比較均顯著升高(P＜0.01); SAP-ICE-I組與SO組NOD1蛋白量各時(shí)間點(diǎn)相比升高(P＜0.01);差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SAP-ICE-I組與SAP-S組相比顯著下降(P＜0.01);三組6h、12 h組

16、相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　8、Western blot檢測(cè)NOD2蛋白表達(dá)情況:SAP-S組與SO組NOD2蛋白量各時(shí)間點(diǎn)比較均顯著升高(P＜0.O1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SAP-ICE-I組與SO組NOD1蛋白量各時(shí)間點(diǎn)相比升高(P＜0.01);SAP-ICE-I組與SAP-S組相比顯著下降(P＜0.01);三組個(gè)亞組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　9、Western blot檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)情況:

17、SAP-S組與SO組NLRP3蛋白量各時(shí)間點(diǎn)比較均顯著升高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SAP-ICE-I組與SO組6h時(shí)間點(diǎn)相比NLRP3蛋白量無(wú)顯著差異(P＞0.05);SAP-ICE-I組與SO組12h組相比NLRP3蛋白量升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SAP-ICE-I組與SAP-S組相比顯著下降（P＜0.01）;SAP-S組6h、12h組相比，6h蛋白的量高于12h，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);SAP-IC

18、E-I組6h、12h組相比，12h蛋白的量高于6h，(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　10、Western blot檢測(cè)caspase-1蛋白表達(dá)情況:SAP-S組與SO組caspase-1蛋白量各時(shí)間點(diǎn)比較均顯著升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SAP-ICE-I組與SO組caspase-1蛋白量相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);SAP-ICE-I組與SAP-S組相比顯著下降（P＜0.01）;SAP-S組6h、12h時(shí)

19、間點(diǎn)相比，6h蛋白的量高于12h，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);SAP-ICE-I組6h、12h組相比，12h蛋白的量高于6h，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、SAP時(shí)腸道中NOD1、NOD2、NLPR3蛋白及mRNA表達(dá)升高，提示三者均參與了重癥急性胰腺炎腸道損傷;
　　2、caspase-1抑制劑通過(guò)抑制caspase-1的活性可以減少血清IL-1β、IL-18水平，對(duì)重癥急性胰腺炎腸道損傷起到