凍存卵巢移植中的ERS及FSH干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)玻璃化凍存小鼠卵巢移植小鼠腎被膜下后，檢測(cè)不同時(shí)段卵巢中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）分子伴侶GRP78、凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Caspase-12的表達(dá)水平，探討凍存移植過(guò)程中是否激活了卵巢內(nèi)ERS，以及移植后卵巢早期發(fā)育中存在的卵泡丟失是否與ERS途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)，采用FSH干預(yù)，探究其干預(yù)效果。
　　方法：
　　4周齡C57BL/6J雌性間期小鼠，取其雙側(cè)卵巢，剝離外膜后縱向?qū)η谐蓛砂耄S機(jī)分

2、為新鮮組、空白組、TM組、保護(hù)劑滲透組、凍存組、TUDCA干預(yù)凍存組、FSH干預(yù)凍存組。各組培養(yǎng)后行腎被膜下移植術(shù)，術(shù)后監(jiān)測(cè)受體鼠動(dòng)情周期的恢復(fù)情況，并且在術(shù)后2天、4天、6天、28天取材，制作石蠟切片。HE染色觀察，移植后28天每組卵巢卵泡的形態(tài)，并做正常卵泡計(jì)數(shù)。并且采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植后2天，4天，6天分組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP78、凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)，Western blotting技術(shù)

3、檢測(cè)GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平。TUNEL法檢測(cè)各組卵巢內(nèi)細(xì)胞凋亡水平。移植后28天取小鼠血清檢測(cè)血清中E2和FSH含量。
　　結(jié)果：
　　（1）常規(guī)玻璃化卵巢凍存移植后，各組卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示TM組、凍存組和保護(hù)劑滲透組卵泡計(jì)數(shù)明顯低于空白組（P<0.05）；動(dòng)情周期恢復(fù)情況顯示TM組、凍存組和保護(hù)劑滲透組動(dòng)情周期的恢復(fù)時(shí)間明顯比空白組延長(zhǎng)（P<0.05），凍存組恢復(fù)時(shí)間最長(zhǎng)（P<0.05）；激素

4、水平測(cè)定結(jié)果顯示：各組E2濃度無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　?。?）凍存過(guò)程加入FSH干預(yù)后，F(xiàn)SH干預(yù)凍存組、TUDCA干預(yù)凍存組卵泡計(jì)數(shù)明顯高于單純凍存組（P<0.05），其動(dòng)情周期恢復(fù)時(shí)間也明顯比凍存組縮短（P<0.05）；激素水平測(cè)定顯示：FSH干預(yù)凍存組、TUDCA干預(yù)凍存組E2激素含量高于單純凍存組(P<0.05)；
　　（3）凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：常規(guī)玻璃化凍存卵巢移植后2天、4天凋亡較強(qiáng)，6天減弱。移植后的第2

5、天、4天，凍存組凋亡明顯強(qiáng)于其余各組（P<0.05）；加入FSH干預(yù)凍存后，相同時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)SH干預(yù)凍存組、TUDCA干預(yù)凍存組的卵泡凋亡明顯減弱（P<0.05），且FSH干預(yù)凍存組凋亡程度明顯低于TUDCA干預(yù)凍存組（P<0.05）；
　?。?）常規(guī)玻璃化凍存移植后檢測(cè)各組ERS標(biāo)志蛋白，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示GRP78蛋白主要表達(dá)于卵泡的顆粒細(xì)胞胞漿中，其表達(dá)在移植后的第2天達(dá)到高峰，4天開(kāi)始減弱。移植后第2天、第4天，凍存組、保

6、護(hù)劑誘導(dǎo)組、TM組GRP78蛋白的表達(dá)明顯高于空白組（P<0.05），Western blotting蛋白定量結(jié)果顯示了相同的趨勢(shì)；CHOP蛋白主要定位于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞胞漿中，在移植后的第2天，第4天表達(dá)高峰，第6天減弱。移植后第2天凍存組、保護(hù)劑滲透組、TM誘導(dǎo)組的CHOP表達(dá)明顯高于空白組（P<0.05）；Caspase-12蛋白主要定位于顆粒細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞胞漿中，在移植后的第2天，第4天表達(dá)達(dá)高峰，第6天減弱。移植后第2天，

7、凍存組、保護(hù)劑滲透組、TM組Caspase-12明顯高于空白組（P<0.05）；
　?。?）常規(guī)玻璃化凍存過(guò)程中加入FSH干預(yù)后，移植后第2，4天，Western blotting蛋白定量結(jié)果顯示FSH干預(yù)凍存組和TUDCA干預(yù)凍存組GRP78蛋白的表達(dá)量明顯低于凍存組（P<0.05），但仍高于空白組（P<0.05）；TUDCA干預(yù)組CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)明顯低于凍存組（P<0.05），但FSH干預(yù)組與凍存組相比沒(méi)

8、有明顯差異；
　　結(jié)論：
　　1.凍存卵巢移植后的生長(zhǎng)早期發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在移植后的第2天最強(qiáng)。發(fā)育的第4天，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)途徑已經(jīng)轉(zhuǎn)向了凋亡途徑。移植后的卵泡發(fā)育過(guò)程中的卵泡丟失跟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。
　　2.FSH的干預(yù)可以提高凍存移植卵巢的正常卵泡數(shù)，而且縮短了受體鼠動(dòng)情周期的恢復(fù)時(shí)間，有利于其E2激素水平的恢復(fù)；FSH的干預(yù)可以減少卵巢凍存移植過(guò)程中的卵泡凋亡；通過(guò)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子的檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)SH減弱內(nèi)