IFN-γ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的建立及其在篩選結(jié)核分枝菌蛋白調(diào)控IFN-γ表達(dá)中的作用.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。結(jié)核病的疫情仍然非常嚴(yán)重，已成為目前全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計(jì)，全球約有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌，2012年有860萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)為130萬。結(jié)核分枝桿菌感染宿主后會(huì)引起宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。其中IFN-γ是抵抗結(jié)核分枝桿菌感染最主要的細(xì)胞因子。IFN-γ是一種Ⅱ型干擾素主要由活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生，能激活巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除具有重要意義。因此

2、本實(shí)驗(yàn)主要是研究對(duì)IFN-γ具有調(diào)控作用的結(jié)核分枝桿菌蛋白。
　　1.候選蛋白的選擇
　　本實(shí)驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株為研究對(duì)象篩選出一些可能對(duì)IFN-γ具有調(diào)控作用的結(jié)核分枝桿菌脂蛋白，膜蛋白和分泌蛋白。通過生物信息學(xué)方法和結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)的綜合考慮本實(shí)驗(yàn)共選取了173個(gè)蛋白基因作為候選基因。針對(duì)這些蛋白的目的基因序列設(shè)計(jì)出使引物所帶有的酶切位點(diǎn)盡量相同PCR的引物。
　　2.候選蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

3、r>　　本實(shí)驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后將克隆得到的目的基因連接至pcDNA3.1-V5/HisB載體中，構(gòu)建了相關(guān)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒173個(gè)。由于本實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建大量的真核表達(dá)質(zhì)粒，因此采用了一些使實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便的方法。首先將酶切位點(diǎn)相同的目的基因同時(shí)進(jìn)行PCR，然后將PCR產(chǎn)物與目的載體同時(shí)酶切回收。接下來測(cè)定回收產(chǎn)物的濃度，將各種目的基因的濃度調(diào)節(jié)一致混合之后同時(shí)與載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，挑取一定數(shù)量的單菌落

4、搖菌、小提質(zhì)粒、酶切鑒定和送測(cè)序。最后通過序列比對(duì)挑選出構(gòu)建成功的質(zhì)粒。
　　3.調(diào)控IFN-γ啟動(dòng)子活性的結(jié)核分枝桿菌蛋白的篩選
　　由于本實(shí)驗(yàn)采用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行篩選，因此需要構(gòu)建IFN-γ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)之后，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增IFN-γ啟動(dòng)子的引物。本實(shí)驗(yàn)以提取的Hela細(xì)胞的基因組為模板成功擴(kuò)增得到了大小為602bp人源IFN-γ啟動(dòng)子的目的基因并將目的基因連接到pGL3-Basic

5、載體上從而成功構(gòu)建了IFN-γ啟動(dòng)子的pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。
　　將所成功構(gòu)建的173個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IFN-γ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶的檢測(cè)。通過篩選得到部分對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子具有調(diào)控作用的蛋白，其中蛋白R(shí)v0720對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子具有一定的抑制作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性;蛋白R(shí)v3623對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子具有一定的刺激作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　

6、4.對(duì)候選蛋白在蛋白水平的研究
　　為了研究結(jié)核分枝桿菌蛋白在蛋白質(zhì)水平對(duì)IFN-γ的調(diào)控本實(shí)驗(yàn)首先選擇了對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子具有明顯調(diào)控作用的蛋白R(shí)v0720、Rv3623。蛋白R(shí)v3763與蛋白R(shí)v0720、Rv3623都屬于膜磷脂蛋白，同時(shí)已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)蛋白R(shí)v3763進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。因此雖然本實(shí)驗(yàn)在雙熒光素酶的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)蛋白R(shí)v3763對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子的調(diào)控作用較弱，但仍然想在蛋白質(zhì)水平研究該蛋白