PCBP2增強(qiáng)IFN-α對(duì)HCV抗病毒活性分子機(jī)制的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是一種正鏈小RNA病毒，由HCV感染引起的丙型肝炎是一種常見(jiàn)的慢性肝臟疾病，60-80％左右的持續(xù)感染者最終會(huì)發(fā)展成肝硬化或肝癌。干擾素α(IFN-α)可用于慢性丙型肝炎治療，IFN-α的臨床應(yīng)用可使得病人血清和肝臟中的HCVRNA持續(xù)清除，達(dá)到對(duì)慢性感染的治愈效果。
　　 宿主細(xì)胞是HCV生命過(guò)程的載體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多宿主細(xì)胞因子能夠參與到HCV的生活周期中去。由于HCV

2、是一種RNA病毒，這些細(xì)胞因子中很大一部分是RNA結(jié)合蛋白（RNA Binding Protein，RBP），這些RBP能與病毒基因組上的順勢(shì)元件結(jié)合而發(fā)揮對(duì)病毒的效應(yīng)。Poly(C) binding protein 2(PCBP2，hnRNP E2或α-CP2)是屬于hnRNP E家族的一種RBP，可以特異性地與單鏈polyC富含區(qū)結(jié)合。在正常的細(xì)胞功能中，PCBP2可參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白相互作用及miRNA的誘騙等機(jī)制中，發(fā)揮其細(xì)胞

3、中對(duì)mRNA的穩(wěn)定性影響和調(diào)控翻譯的作用。PCBP2還可參與到許多RNA病毒的復(fù)制和翻譯過(guò)程，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、鼻病毒(Rhinovirus)等，這些RNA病毒都是與HCV結(jié)構(gòu)相似的微小核糖核酸病毒。研究證實(shí)PCBP2能結(jié)合HCV基因組的5’-UTR和3’-UTR區(qū)域，提示PCBP2和HCV之間也有著某種聯(lián)系，然而PCBP2對(duì)HCV生命過(guò)程所起的作用還并不確切。

4、>　　 HCV復(fù)制子（Replicon）細(xì)胞模型的建立對(duì)HCV的體內(nèi)分子機(jī)制研究起到了重要的推動(dòng)作用，該系統(tǒng)中遺傳修飾后的HCV RNA(Replicon)可在人肝癌細(xì)胞系中有效地?cái)U(kuò)增，從而可反映病毒在細(xì)胞中的生命活動(dòng)。在我們的初期研究中發(fā)現(xiàn)PCBP2不同于其它與HCV有相互作用的RBP，在HCV復(fù)制子細(xì)胞R1b中表達(dá)下調(diào)而不是上調(diào)。通過(guò)對(duì)HCV NS蛋白在野生型Huh7.5.1細(xì)胞中的異位表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HCVNS4B和NS5A蛋白的表達(dá)

5、能顯著地抑制PCBP2的表達(dá)水平，Realtime PCR結(jié)果表明NS4B對(duì)PCBP2的抑制可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，而NS5A則可能在轉(zhuǎn)錄水平抑制PCBP2的表達(dá)。R1b細(xì)胞中對(duì)PCBP2的抑制可以通過(guò)IFN-α的作用而回復(fù)。我們用IFN-α處理R1b細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)HCV的RNA和蛋白表達(dá)都受到抑制，而PCBP2的表達(dá)則逐漸回復(fù)，具有劑量依賴性，并且在IFN-α治愈的R1b細(xì)胞中PCBP2的表達(dá)不再回調(diào)。這種回復(fù)作用在其它肝臟細(xì)胞系中沒(méi)有發(fā)生

6、，進(jìn)一步說(shuō)明PCBP2在R1b細(xì)胞中的抑制是由于HCVNS蛋白造成的。
　　 為了研究PCBP2對(duì)HCV的真正作用機(jī)制，我們?cè)赗1b細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和敲低了PCBP2，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)和敲低PCBP2對(duì)HCV的復(fù)制都沒(méi)有顯著影響。有意思的是，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)PCBP2的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IFN-α對(duì)HCV的抑制活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)IFN-a和利巴韋林聯(lián)合作用也有相同的效應(yīng)，而對(duì)利巴韋林單獨(dú)作用沒(méi)有影響。在PCBP2敲低的細(xì)胞中也有相應(yīng)的效應(yīng)。

7、這些結(jié)果證實(shí)PCBP2能夠增強(qiáng)IFN-a的作用而對(duì)利巴韋林無(wú)效。
　　 PCBP2對(duì)IFN-a的作用機(jī)制研究中，我們利用RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation)技術(shù)來(lái)研究IFN-α信號(hào)通路分子中是否有PCBP2的作用底物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT1和STAT2的mRNA能富集在PCBP2的蛋白-RNA復(fù)合體中，與陽(yáng)性底物α-globin相當(dāng)，表明STAT1和STAT2的mRNA可能是PCBP2的靶mRNA，且PC

8、BP2對(duì)STAT1和STAT2 mRNA的結(jié)合可導(dǎo)致其總蛋白及其磷酸化水平的上調(diào)。進(jìn)一步通過(guò)RNA Pull Down技術(shù)，在STAT1和STAT2 mRNA的3’-UTR中，分別找到了PCBP2的結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合區(qū)域中都含有富含polyC的片段以及PCBP2識(shí)別的核心序列。
　　 通過(guò)Realtime PCR和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase Protection Assay，RPA)，我們進(jìn)一步證實(shí)PCBP2能上調(diào)STAT1和S

9、TAT2的mRNA水平。其機(jī)制是結(jié)合mRNA后，可增強(qiáng)兩者mRNA的穩(wěn)定性，大大延長(zhǎng)其半衰期。STAT1和STAT2 mRNA的穩(wěn)定性延長(zhǎng)使得兩者總蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)IFN-α對(duì)HCV的抑制活性。
　　 本研究揭示了PCBP2對(duì)IFN-α的抗HCV活性中起著重要的作用，并有可能指導(dǎo)臨床上使用IFN-α對(duì)HCV感染的個(gè)體治療。同時(shí)我們揭示了RNA結(jié)合蛋白與HCV病毒之間一種相互作用的新機(jī)制，即通過(guò)增強(qiáng)IFN-α的效應(yīng)而不是直