牛IFn-ω家族抗病毒活性的研究及牛共有IFn-ω的研制.pdf

1、機(jī)體在感染病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌時(shí)，Ⅰ型干擾素直接或/和間接的通過其他調(diào)節(jié)因子的誘導(dǎo)對(duì)先天性和獲得性免疫細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響。Ⅰ型干擾素對(duì)宿主抵抗病毒也有很重要的作用。BoIFN-ω屬于Ⅰ型干擾素，本研究從NCBI網(wǎng)站上搜索得到牛干擾素omega(BoIFN-ω)家族24個(gè)成員的核苷酸序列，DNAMAN序列分析軟件分析發(fā)現(xiàn)24個(gè)成員中有22個(gè)成員是潛在的功能基因，另外2個(gè)為假基因，并根據(jù)其在染色體的先后順序?qū)ζ涿?br>　　本研究通

2、過對(duì)22條潛在的功能基因序列比對(duì)分析，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并以牛肝基因組為模板擴(kuò)增出了BoIFN-ω家族的14個(gè)功能基因成員。序列分析結(jié)果表明，BoIFN-ω家族的14個(gè)成員核苷酸相似性為91.3％～97.2％，氨基酸相似性為84.4％～95.4％。14個(gè)成員中除BoIFN-ω11在-COOH端缺失9個(gè)氨基酸外，其余都編碼195個(gè)氨基酸。它們均含有23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，且在成熟肽的1、29、99和139位置有4個(gè)保守的半胱氨酸，其中1和99

3、，29和139位置的半胱氨酸可以形成兩個(gè)二硫鍵。根據(jù)進(jìn)化樹構(gòu)建和序列比對(duì)分析，選取BoIFN-ω家族中的8個(gè)成員進(jìn)行原核表達(dá)，并分析比較其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。研究表明這8個(gè)成員都有抗VSV活性，其活性均可以被兔抗BoIFN-ω24多克隆血清阻斷。在MDBK細(xì)胞上抗病毒活性最高的BoIFN-ω13是抗病毒活性最低的BoIFN-ω11的47.5倍。BoIFN-ω10/11/24的抗病毒活性相比較低，BoIFN-ω13/17/23的抗病毒活

4、性相比較高。經(jīng)過pH2.0和63℃處理后其抗病毒活性都降低，但仍然具有較高的抗病毒活性。抗細(xì)胞增殖活性研究表明，8個(gè)BoIFN-ω成員均能夠抑制MDBK細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性。用熒光定量PCR方法檢測(cè)8個(gè)BoIFN-ω成員在MDBK細(xì)胞上對(duì)Mx1基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示經(jīng)BoIFN-ω處理過的MDBK細(xì)胞中Mx1的mRNA都有不同程度的增多。
　　根據(jù)人共有干擾素的設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)了牛共有干擾素(CoBoIFN-ω）。CoBoI

5、FN-ω是一種重組的非天然的BoIFN-ω，其氨基酸的產(chǎn)生是通過比較BoIFN-ω家族的22個(gè)具有潛在功能的成員序列后，把出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分配到各自相應(yīng)的位置設(shè)計(jì)出來的。設(shè)計(jì)出來的序列經(jīng)過畢赤酵母密碼子優(yōu)化后，在畢赤酵母中表達(dá)。CoBoIFN-ω的抗病毒活性和抗細(xì)胞增殖活性都比天然的BoIFN-ω高。此外CoBoIFN-ω處理的MDBK細(xì)胞Mx1的mRNA水平高于天然的BoIFN-ω。CoBoIFN-ω在MDBK和PK-15細(xì)胞上的