致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島雙重PCR方法建立與應(yīng)用.pdf

1、致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)和沙門氏菌(Salmonellaspp.)是引起食源性疾病的兩種重要的致病菌。流行病學報告表明，大腸桿菌和沙門氏菌的致病性與其自身攜帶的毒力島基因具有相關(guān)性。毒力島的發(fā)現(xiàn)和研究，對深入了解細菌性疾病的發(fā)生發(fā)展過程以及對疾病的預(yù)防控制都有著深遠影響。
　　 本課題根據(jù)致病性大腸桿菌和沙門氏菌毒力島標志性基因設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)分別對這兩種細菌的毒力島基因進行特

2、異性擴增，通過擴增條件的優(yōu)化及引物組合配對，進而建立致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島基因的雙重PCR檢測方法，試圖達到對這兩種細菌的快速同步檢測。運用該方法對畜禽大腸桿菌和沙門氏菌進行調(diào)查，旨在為人畜共患大腸桿菌病和沙門氏菌病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。
　　 具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、大腸桿菌、沙門氏菌毒力島標志性基因的PCR檢測
　　 本研究以致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島為切入點，根據(jù)GenBank中

3、已發(fā)表的致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島標志性基因序列，分別設(shè)計合成了致病性大腸桿菌毒力島irp1、irp2和fyuA，沙門氏菌毒力島mgtC、sseL和sopB等6對特異性引物，提取大腸桿菌(CVCC1565)菌株和沙門氏菌(ATCC9150)菌株的DNA作為模板，對致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島基因進行PCR檢測，并對擴增反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，致病性大腸桿菌毒力島標志性基因引物irp1、irp2和fyuA能擴增出大腸桿菌(CVC

4、C1565)毒力島片段，大小分別是799bp，414bp和948bp；沙門氏菌毒力島標志性基因引物mgtC、sseL和sopB能擴增出沙門氏菌(ATCC9150)毒力島片段，大小分別是500bp，269bp和1000bp。實驗選取了對擴增效率影響較大的引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度這兩個重要參數(shù)進行了優(yōu)化研究，結(jié)果顯示所建立的PCR優(yōu)化體系為25μL，包括0.5μL引物F(100um)，0.5μL引物R(100um)，0.5μLTaq

5、DNA聚合酶(5U)，2.5μL10×PCR緩沖液(Mg2+)，2.5μLDNA模板，1.0μLdNTP(10mM)，加滅菌超純水至25μL。
　　 2、致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島基因雙重PCR檢測方法的建立
　　 根據(jù)PCR優(yōu)化體系，對致病性大腸桿菌毒力島標志性基因irp1、irp2和fyuA引物和沙門氏菌毒力島標志性基因，mgtC、sseL和sopB引物進行特異性實驗，結(jié)果表明，引物irp1、irp2和fyuA僅

6、能擴增出大腸桿菌(CVCC1565)的特異性片段，引物，mgtC、sseL和sopB僅能擴增出鼠傷寒沙門氏菌(ATCC9150)的特異性片段。為進一步尋找雙重PCR最優(yōu)引物組合，設(shè)計2組引物組合，引物組合1為致病性大腸桿菌fyuA基因&沙門氏菌mgtC基因，引物組合2為致病性大腸桿菌fyuA基因&沙門氏菌sseL基因，根據(jù)最終擴增效果選擇引物組合1：致病性大腸桿菌fyuA基因&沙門氏菌mgtC基因建立致病性大腸桿菌、沙門氏菌雙重PCR檢

7、測方法。敏感性試驗結(jié)果表明致病性大腸桿菌和沙門氏菌的最低檢測限分別為2.2×101cfu·mL-1和2.0×101cfu·mL-1。以上數(shù)據(jù)說明該研究建立的致病性大腸桿菌、沙門氏菌的雙重PCR檢測方法敏感性高、特異性強。
　　 3、致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島雙重PCR檢測方法的應(yīng)用
　　 本研究選取合肥附近的屠宰場養(yǎng)殖場共采集糞便樣品24份，通過對采集的畜禽糞便樣品進行了分離，培養(yǎng)及生化鑒定，篩選出符合大腸桿菌和沙門

8、氏菌特征的菌株各有24株。運用建立的致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島基因的雙重PCR檢測方法對篩選的畜禽大腸桿菌沙門氏菌進行檢測。結(jié)果顯示：在24株畜禽大腸桿菌分離株中，有20株檢測出具有大腸桿菌毒力島fyuA基因，檢出率為83.3％；在24株畜禽沙門氏菌分離株中，有23株檢測出具有沙門氏菌毒力島mgtC基因，檢出率為95.8％。以上數(shù)據(jù)說明該研究建立的致病性大腸桿菌、沙門氏菌的雙重PCR檢測適用于畜禽大腸桿菌和沙門氏菌的快速診斷與分子流