肥胖相關(guān)基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性研究.pdf

1、前言和背景:
　　 目前認(rèn)為，冠心病是一種多基因遺傳復(fù)雜疾病，肥胖是公認(rèn)的冠心病危險(xiǎn)因素之一。脂肪量與肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated， FTO)基因是至今為止研究證實(shí)最強(qiáng)最確定的肥胖易感基因。自2007年Frayling首次報(bào)道，F(xiàn)TO基因與肥胖相關(guān)以來(lái)，大量全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí):在全世界大多數(shù)不同人種人群中，F(xiàn)TO基因多態(tài)性與體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、肥胖、胰島素抵抗及糖尿病(DM)、代謝

2、綜合征、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及C-反應(yīng)蛋白顯著關(guān)聯(lián)。冠心病的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，其發(fā)生發(fā)展與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)，肥胖、糖尿病、炎癥等均參與其發(fā)病及病情進(jìn)展，而從某種意義上講，糖尿病等于冠心病。因此，我們假設(shè)冠心病與肥胖、糖尿病可能具有共同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，F(xiàn)TO基因多態(tài)性可能與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
　　 據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前國(guó)內(nèi)外僅有少數(shù)幾個(gè)學(xué)者在FTO基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor

3、phism，SNP）與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn):FTO基因SNP與DM合并冠心病有相關(guān)性。2010年Hubacek等首次研究表明:在男性白色人種中FTO基因rs17817449多態(tài)性與急性冠脈綜合征顯著相關(guān)。而對(duì)于非洲印第安人的研究表明:急性心肌梗死并代謝綜合征與肥胖相關(guān)基因多態(tài)性并不相關(guān)。對(duì)于FTO基因SNP與冠心病的關(guān)聯(lián)研究尚處于不確定階段，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于FTO基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性研究的報(bào)道，且不同人種具有遺傳異質(zhì)性，全基因組

4、關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)的冠心病易感基因，需要在不同人種大樣本研究中得到重復(fù)驗(yàn)證。
　　 近十年來(lái)的研究表明瘦素(leptin)與肥胖、血脂異常、胰島素抵抗、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等關(guān)聯(lián)，是冠心病的易患因素之一。LEP基因也是肥胖相關(guān)基因，編碼瘦素，Lep基因與FTO基因同是通過(guò)作用于下丘腦，而抑制飲食，調(diào)節(jié)能量平衡，其基因多態(tài)性變異導(dǎo)致肥胖。研究亦證實(shí)瘦素與FTO基因存在關(guān)聯(lián)，具體機(jī)制尚不清楚。FTO基因與肥胖相關(guān)的SNP均大致

5、定位于第1內(nèi)含子，第1內(nèi)含子在遺傳上被證實(shí)具有高度保守性。研究最為深入的位點(diǎn)rs9939609、rs17817449與其他位點(diǎn)呈強(qiáng)連鎖不平衡，且基因型分型研究成功率很高。GWAS目前研究熱點(diǎn)，主要是通過(guò)疾病易感基因單核苷酸多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)，研究復(fù)雜疾病的遺傳機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)選擇典型位點(diǎn)FTO rs9939609，rs17817449以及LEP rs10954174對(duì)其SNPs與冠心病的關(guān)系進(jìn)行研究。
　　 本研究采用病例對(duì)照的

6、全基因組關(guān)聯(lián)研究方法，首次對(duì)中國(guó)漢族冠心病患者肥胖相關(guān)基因3個(gè)SNPs多態(tài)性進(jìn)行分析，采用基因多態(tài)性研究可靠性精確度最高的直接測(cè)序方法確定FTO、LEP基因SNP位點(diǎn)的基因型，探討FTO、LEP基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病及其相關(guān)臨床表型（高血壓、高血脂、高血糖、高同型半胱氨酸等）的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證冠心病FTO基因與LEP基因SNP位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因，為從基因水平篩查冠心病高危人群提供依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.重復(fù)和

7、驗(yàn)證中國(guó)漢族冠心病患者肥胖相關(guān)基因FTO基因位點(diǎn)rs9939609(A/T)、rs17817449(G/T)和LEP基因位點(diǎn)rs10954174(G/A)多態(tài)性;
　　 2.探討上述3個(gè)肥胖相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性SNPs和冠心病的相關(guān)性;
　　 3.探討上述3個(gè)SNPs多態(tài)性與冠心病相關(guān)臨床性狀（肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病、高尿酸、高同型半胱氨酸等）的相關(guān)性，比較不同基因型的臨床代謝、生化指標(biāo)的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8、
　　 對(duì)象和方法:
　　 1.隨機(jī)選擇2012年1月至2012年12月深圳市龍崗中心醫(yī)院心內(nèi)科住院冠心病患者147例，男127例，女20例，年齡40～72歲，平均年齡(57.22±10.56)歲。同期住院的98例非CAD患者為對(duì)照組，男88例，女10例，年齡38～72歲，平均年齡(54.24±8.49)歲。入選研究對(duì)象均為漢族且均簽署知情同意書(shū)。對(duì)所有符合入選標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象均常規(guī)收集下列臨床資料:年齡、性別、早發(fā)心血管

9、病家族史、高血壓、糖尿病、腦卒中等相關(guān)病史、飲酒、吸煙史、體力活動(dòng)和主要飲食習(xí)慣等?？崭箿y(cè)量身高、體重、腹圍(WC)及血壓(blood pressure，BP)，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)=體重（公斤）/身高（米）2(kg/m2)。實(shí)驗(yàn)室檢查以下生化指標(biāo):空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(h

10、igh density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、尿酸(uric acid, UA)、同型半胱氨酸(Homocysteine，HCy)等，采用美國(guó)羅氏全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。
　　 2.肥胖相關(guān)基因基因多態(tài)性檢測(cè):
　　 ①基因組DNA的制備:清晨空腹用EDTA抗凝管抽取外周靜脈血3

11、ml，采用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司全血DNA快速提取試劑盒（25次量）抽提全血基因組DNA。電泳鑒定基因組DNA純度。
　　 ②聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增:設(shè)計(jì)FTO基因位點(diǎn)rs9939609(A/T)、rs17817449(G/T)和LEP基因位點(diǎn)rs10954174(G/A)各自雙向引物。通過(guò)PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因片段，PCR反應(yīng)總體系30ul，包括:10×rTaq buffer(10×緩沖液)3ul，dNTP(2.5

12、 mM)2 ul，正向、反向引物(10mM)各1 ul，DNA模板2 ul，Taq DNA聚合酶(r Taq)0.2 ul，50％ DMSO1 ul，去離子水19.8 ul。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃變性20 sec，55℃退火20sec，72℃延伸30sec，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸5min，12℃保存。
　　 ③測(cè)序前DNA模板處理:PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳鑒定，PCR擴(kuò)

13、增的目的基因片段，rs9939609擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為226bp;rs17817449為253bp; rs10954174為257bp。PCR產(chǎn)物純化，按照Millipore公司96純化板操作流程操作處理。純化后方可作為測(cè)序前DNA模板。
　　 ④基因型檢測(cè)采用美國(guó)ABI3730型（Applied Biosystem）基因分析儀全自動(dòng)化測(cè)序進(jìn)行基因多態(tài)分型。建立單引物PCR測(cè)序反應(yīng)體系:rs9939609、rs17817449、r

14、s10954174相應(yīng)的PCR純化后產(chǎn)物作為測(cè)序模板DNA3μl（30-50 ng），單向引物(rs9939609R，rs17817449 R，rs10954174 F)(3 pM)1μl，Bigdye Mix0.5μl，ddH2O0.5μl，總反應(yīng)體積5μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10s，51℃退火10s，60℃延伸190 s，25次循環(huán)。按照分析儀操作說(shuō)明，按編程設(shè)定程序后自動(dòng)次序進(jìn)樣，毛細(xì)管電泳，激光檢測(cè)器檢

15、測(cè)熒光，分析DNA堿基序列，儀器自動(dòng)數(shù)據(jù)分析得出樣本FTOrs9939609、rs17817449和LEP rs10954174基因型。本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是Bigdye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒，由北京六合華大基因科技股份有限公司協(xié)助完成。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:統(tǒng)計(jì)分析比較冠心病組和對(duì)照組之間基本臨床資料的差異，分析FTO基因rs9939609、rs17817449，LEP基因rs10954174各位點(diǎn)等位基因及基因型

16、頻率分布，以及FTO、LEP不同基因型頻率分布之間各生化、代謝指標(biāo)的分布差異。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較采用one-way ANOVA分析。計(jì)數(shù)資料以率比較，組間比較用X2檢驗(yàn)。以x2檢驗(yàn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用logistic回歸分析不同基因型頻率分布與冠心病的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

17、　　 結(jié)果:
　　 1.一般臨床資料比較:147例冠心?。ú±M）以及98例非冠心病患者（對(duì)照組）的一般臨床資料比較，年齡、吸煙、高血壓病史、高脂血癥病史、腰圍(WC)、空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)及同型半胱氨酸(HCY)，冠心病組均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。性別、既往糖尿病、痛風(fēng)史、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓(S

18、BP)、舒張壓(DBP)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及尿酸(UA)，在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.CAD組和對(duì)照組中，F(xiàn)TO基因FTOrs9939609、rs17817449基因型和LEPrs10954174基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡(P＞0.05)。
　　 3.CAD組和對(duì)照組中FTO rs9939609等位基因及基因型頻率比較:C

19、AD組147例中，F(xiàn)TO rs9939609 TT基因型108例，AT型39例，表達(dá)頻率分別為73.47％、26.53％，未檢測(cè)到AA基因型。A等位基因頻率為13.27％，T等位基因頻率為86.73％。98例對(duì)照組中，TT基因型72例，AT型26例，頻率分別為73.50％、26.50％，未檢測(cè)到AA基因型;A等位基因頻率為13.30％，T為86.70％。兩組基因型及A、T等位基因分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　

20、　 4.CAD組和對(duì)照組中FTO rs17817449等位基因及基因型頻率比較:CAD組147例中，rs17817449 GG基因型7例，GT型35例，TT型105例，表達(dá)頻率分別為4.8％、23.8％和71.4％，G等位基因頻率為16.67％，T為83.33％。對(duì)照組98例中，TT基因型83例，占84.7％，GT基因型14例，占14.3％，GG基因型1例，占1％。等位基因頻率:T為91.8％，G為8.2％。攜帶G等位基因的基因型與不

21、攜帶的純合子TT基因型比較，冠心病風(fēng)險(xiǎn)增高，是TT基因型的4.85倍(P=0.038，OR=4.85，95％CI:0.587～40.053)。攜帶至少一個(gè)G等位基因患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)是不攜帶者的2.250倍(P=0.007， OR=2.250,95％ CI:1.239～4.084)。
　　 5.CAD組和對(duì)照組中LEP rs10954174等位基因及基因型頻率比較:147例CAD組LEP基因rs10954174 GG基因型137例，

22、占93.2％， GA基因型10例，占6.8％，未檢測(cè)到AA基因型。G等位基因頻率為96.6％，A為3.4％;對(duì)照組98例，GG型90例，占91.8％，GA型8例，占8.2％，未檢測(cè)到AA基因型。等位基因頻率:G為95.92％，A為4.08％。CAD組LEPrs10954174A等位基因及GA+AA基因型分布頻率低于對(duì)照組，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6.FTO基因SNP位點(diǎn)rs9939609和rs178174

23、49呈強(qiáng)連鎖不平衡:連鎖不平衡檢驗(yàn)(D=3.4％，r2=0.97＞0.33)。
　　 7.3個(gè)SNPs不同基因型的臨床代謝生化指標(biāo)比較:FTO基因rs9939609AT+AA基因型的高血壓病史、高脂血癥病史、BMI、WC、SBP、DBP、FPG、TC、LDL-C水平均高于TT基因型的，二者比較差異顯著(P＜0.05);FTO rs17817449 GG基因型的BMI、WC、SBP、LDL-C水平均高于TT基因型的，性別、吸煙史、

24、高血壓病史，二者比較均差異顯著(P＜0.05); LEP基因rs10954174 GG基因型與GA+AA基因型比較，所有研究指標(biāo)包括:性別、年齡、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、痛風(fēng)及高脂血癥史、BMI、WC、SBP、DBP、UA、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C及同型半胱氨酸，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8.Logistic回歸分析結(jié)果提示，影響冠心病發(fā)病的因素有年齡、腰圍(WC)、BMI、空腹血糖(F

25、PG)、甘油三酯(TG)、HDL-C、吸煙、高脂血癥史以及FTO基因rs17817449 G等位基因。其中危險(xiǎn)因素有體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、HDL-C、高脂血癥史和rs17817449 G等位基因。rs17817449 G等位基因與冠心病呈相關(guān)性(P＜0.05，OR值25.81，95％ CI:2.348～285)，且獨(dú)立于BMI、WC及高血壓病、糖尿病及血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血尿酸、血同型

26、半胱氨酸等風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論:
　　 ①FTO基因位點(diǎn)rs9939609(A/T)多態(tài)性與冠心病無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，rs9939609 A等位基因攜帶者的高血壓病史、高脂血癥史、BMI、WC、SBP、DBP、FPG、TC、LDL-C水平均高于TT基因型的，攜帶A等位基因可能是冠心病的易感因素。
　　 ②FTO基因位點(diǎn)rs17817449(G/T)多態(tài)性與冠心病顯著關(guān)聯(lián)，G等位基因是冠心病的風(fēng)險(xiǎn)基因，攜帶GG基因型的中

27、國(guó)漢族人冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型者。
　　 ③在中國(guó)漢族人群中重復(fù)證實(shí)FTO rs9939609和rs17817449呈強(qiáng)連鎖不平衡。
　　 ④初步研究得出LEP rs10954174(A/G)多態(tài)性與冠心病無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。
　　 ⑤本研究重復(fù)和驗(yàn)證了在中國(guó)漢族人中肥胖相關(guān)基因FTOrs9939609，rs17817449 SNPs多態(tài)性與BMI、WC顯著相關(guān)。LEPrs10954174則與冠心病及冠心病相關(guān)性狀