根皮苷對db-db小鼠糖尿病心肌病變保護機制的定量蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、第一部分根皮苷對db/db小鼠糖尿病心肌病變保護機制的定量蛋白質(zhì)組學研究
　　 研究背景
　　 糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一種由于胰島素絕對或相對分泌不足而導致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的一種常見內(nèi)分泌代謝性疾病。近年來，DM的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，已成為嚴重威脅人類健康與生活質(zhì)量的世界性公告衛(wèi)生問題。DM不僅僅表現(xiàn)為長期慢性的血糖升高，還可伴有多種并發(fā)癥。其中心血管并

2、發(fā)癥已經(jīng)成為DM并發(fā)癥中致殘率和致死率最高、危害最大的并發(fā)癥。
　　 糖尿病性心臟病是糖尿病患者致死的主要原因之一，尤其是在2型糖尿病患者中。廣義的糖尿病心臟病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。悄虿⌒募〔∽兒吞悄虿⌒呐K自主神經(jīng)病變等。糖尿病心臟病與非糖尿病患者相比常起病比較早，糖尿病患者伴冠心病常表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，梗死面積比較大，穿壁梗死多，病情多比較嚴重，預后比較差，病死率較高;如冠狀動脈造影和臨床排除冠狀動脈病變

3、，糖尿病患者出現(xiàn)嚴重的心律失常心臟肥大肺淤血和充血性心力衰竭，尤其是難治性心力衰竭臨床可考慮糖尿病心肌病(DiabeticCardimyopathy,DCM)。DCM是指發(fā)生在DM中，不能用高血壓性心臟病、冠心病、心臟瓣膜病及其他心臟病來解釋的心肌疾病。這一疾病在代謝紊亂及微血管病變的基礎上引發(fā)心肌廣泛灶性壞死，出現(xiàn)亞臨床心功能異常，最終進展為心律失常、心力衰竭及心源性休克。迄今為止，針對糖尿病引起的心肌損傷目前尚無特效療法，臨床治療首

4、先是控制DM，然后主要針對心肌損害、心律失常、心力衰竭和抗血栓進行治療。而且由于部分患者早期并無明顯癥狀，而上述治療方法均存在一定局限性，并不能有效及時的阻止它的的發(fā)展。因此，在臨床實踐中迫切需要尋找能有效防治糖尿病心肌病變的新型藥物與途徑，進一步完善與充實糖尿病心肌病變的治療策略。
　　 根皮苷(phlorizin，PHL)是根皮素(phloretin)的2'-β-D-葡萄糖苷，是從蘋果，蘋果樹皮及葉中提取的一種二氫查爾酮苷。

5、大量研究表明，PHL具有多種生物活性與藥理作用，如調(diào)節(jié)血糖、抗炎、抗腫瘤、改善認知以及抗氧化等等，目前已被應用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領域。近年來，PHL作為新型藥物在防治DM及其并發(fā)癥中的作用獲得廣泛關注。動物實驗發(fā)現(xiàn)，長期口服PHL對DM并發(fā)癥的靶器官如腎臟、心臟、大動脈和視網(wǎng)膜的病變都起到顯著地保護和改善作用。雖然臨床研究已經(jīng)證實了PHL對于DM患者心臟的保護作用，但是PHL對糖尿病心肌病變的改善及其保護作用的可能機制，目前國內(nèi)外鮮

6、見報道;PHL治療糖尿病心肌病變的作用分子靶點也尚未明確。
　　 同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學定量研究技術，具有良好的定量效果、較高的重復性，并可對多達四種不同樣本同時進行定量分析。目前，iTRAQ技術已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學的定量研究中得到了極其廣泛的應用。但是，國內(nèi)外尚無報道采用iTRAQ標

7、記及相關分析技術來研究根皮苷對2型糖尿病心肌損傷的保護機制。
　　 因此，在本研究中，我們應用了目前較為普遍認可的db/db小鼠的2型DM動物模型，通過10周的PHL灌胃，觀察PHL對于db/db小鼠體重、血糖、血脂、血膽固醇及血中AGEs水平的影響，并對db/db小鼠的心臟進行了組織病理學和超微結構的形態(tài)學觀察，旨在觀察天然藥物PHL治療對于db/db小鼠體重、DM有關代謝指標的影響及其對心臟的保護作用，為臨床治療糖尿病性心臟

8、病提供新的治療思路與途徑。另外，我們還應用了iTRAQ蛋白質(zhì)組學定量技術，TurboSEQUEST軟件和國際蛋白質(zhì)索引(internationalproteinindex，IPI)數(shù)據(jù)庫檢索等生物信息學方法，分離與鑒定正常對照組（CC組），db/db小鼠組（DM組）與db/db小鼠PHL治療組（DMT組）等小鼠心肌組織的差異表達蛋白，旨在揭示PHL對于db/db小鼠糖尿病心肌病變變的分子保護機制，為開展藥物研發(fā)工作、尋找新的藥物靶標開辟

9、新途徑，為臨治療提供新的思路。
　　 研究目的
　　 1.研究db/db小鼠在糖尿病進展中體重及有關代謝指標的變化，通過對db/db小鼠的心臟組織病理學和超微結構的形態(tài)學觀察，評價糖尿病心肌病變的特征與程度。初步探討db/db小鼠糖尿病心肌病變的差異表達蛋白的特征，進一步了解糖尿病心肌病變的分子機制。
　　 2.研究PHL對db/db小鼠體重及糖尿病有關代謝指標的變化的影響，通過對db/db小鼠的心臟組織病理學和

10、超微結構的形態(tài)學觀察，評價PHL對糖尿病心肌病變的保護作用。探討db/db小鼠經(jīng)PHL治療后心肌組織的差異表達蛋白，根據(jù)其所參與的生物過程和代謝通路篩選出藥物作用的關鍵蛋白與候選靶標，進一步揭示PHL對于糖尿病心肌病變的保護機制，為臨床治療提供新的理論基礎。
　　 研究方法
　　 7周齡的雄性C57BLKS/Jdb/db小鼠16只，以及7周齡雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠8只。小鼠均予觀察1周后開始正式實驗。用C57

11、BLKS/Jdb/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，C57BLKS/Jdb/db小鼠分為兩組:一組隨機8只小鼠為DM模型組(DM)，每日用生理鹽水灌胃;另一組隨機8只為PHL干預組(DMT)，每日用體積相同生理鹽水的20mg/kg/d的PHL溶液灌胃，干預時間為10周。實驗期間每周定期測量每只小鼠的體重并記錄。實驗結束時，所有小鼠空腹過夜并處死，采血檢測空腹血糖(FBG)，血甘油三酯(TG)，血總膽固醇(TC)及血清糖基化終末代謝產(chǎn)物(

12、AGEs)等指標;并迅速分離心臟組織，按照病理取材常規(guī)制作心肌石蠟切片。剩余心臟組織分離后立即存于液氮-80℃保存留待進一步蛋白質(zhì)組學實驗用。
　　 從正常對照組（CC組），db/db小鼠組（DM組）與db/db小鼠PHL治療組（DMT組）三組小鼠中各選取4只，分離心臟。每只小鼠取50mg心臟組織，進行心肌組織研磨、切碎、超聲破碎、裂解來提取心肌總蛋白。各組取60ug肽段消化后用iTRAQ染料進行標記，正常對照組用114標記，P

13、HL干預組用116標記，db/db糖尿病組用117則標記。將各組已標記的肽段混合，用強陽離子交換柱(strongcationexchange，SCX)進行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并成10組。接下來用ThermoFinniganLTQVelos質(zhì)譜儀進行液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)。最后，使用相關軟件將定量及檢定結果進行合并處理，得到定量和鑒定結果。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為ipi.MOUSE.v3.72.REVER

14、SED.fasta蛋白庫（Sequest結果過濾參數(shù)為:ProteinFDR≤0.01;PeptideFDR≤0.01），應用EXPASY蛋白質(zhì)組學工具來分析等電點、分子量等。然后采用IngenuityPathwayAnalysis軟件(www.ingenuity.com)對經(jīng)鑒定的心肌蛋白質(zhì)進行蛋白功能和通路的分析。最后將篩選出的部分差異蛋白用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Westernblot)進一步驗證其在心肌組織中的表達。
　　

15、研究結果
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長良好，精神狀況佳，毛發(fā)光亮順澤，活躍。DM組小鼠在實驗進程中，逐漸表現(xiàn)為毛發(fā)污穢無光澤，被毛蓬松，少動，出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿，體重迅速增加。而DMT組小鼠的上述表現(xiàn)較DM組有所減輕。
　　 2.PHL對db/d小鼠體重、FBG、TG、TC與AGEs的影響
　　 隨著觀察時間的延長，DM組與DMT組小鼠的體重較對照組呈顯著增加。從實驗第2周開始，DM組

16、小鼠體重逐漸增加，一直持續(xù)到實驗結束的第10周(P＜0.05)。然而，DMT組小鼠與DM組相比，PHL灌胃顯著改善了DM小鼠體重的快速增加(P＜0.05)。
　　 實驗開始時，各組小鼠的血FBG、TG、TC及AGES水平無明顯差異。至實驗結束時DM組小鼠的FBG、TG、TC及AGES水平與CC組比較，均明顯升高(P＜0.05)。給予PHL干預的DMT組小鼠的FBG、TG、TC及與AGES水平與DM組比較則明顯下降(P＜0.05)

17、。
　　 3.PHL對db/db小鼠心肌組織病理學變化的影響
　　 實驗結束后，將db/db小鼠心肌組織切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色進行觀察。DM組的小鼠的心肌組織較CC組呈現(xiàn)出明顯的心肌細胞肥大和心肌細胞排列不規(guī)則，并伴有細胞核損傷。然而，DMT組經(jīng)過PHL的治療大大減少了心肌組織肥大以及細胞核損傷的情況。
　　 4.PHL對db/db小鼠心肌組織超微結構變化的影響
　　 通過電子顯微鏡下對db/d

18、b小鼠心肌組織超微結構的觀察，發(fā)現(xiàn)CC組小鼠心肌細胞肌原纖維完整，排列整齊，線粒體結構正常，呈線性排列;細胞核形態(tài)良好，核膜完整。而DM組心肌細胞中可以觀察到線粒體腫脹，嵴溶解，有很大區(qū)域的肌原纖維及線粒體排列混亂不規(guī)則;細胞核的形態(tài)有所改變，核膜不完整。然而，在DMT組，PHL的治療明顯的降低了心肌細胞中損傷的線粒體的數(shù)量，并且減輕了肌原纖維的不規(guī)則排列情況。
　　 5.iTRAQ鑒定結果
　　 經(jīng)LS-ESI-MS/

19、MS鑒定并予軟件分析、數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出蛋白1627種，符合鑒定條件者可信蛋白1591中，具有唯一肽段7836個。其中鑒定在DM組與正常對照組心肌蛋白相比表達有變化但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達蛋白共113個，其中在DM組表達上調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有29個，在DM組表達下調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有84個。
　　 6.PHL干預后重要差異蛋白質(zhì)特征
　　 在這些經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)一些涉

20、及到糖尿病心肌病變發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，并把它們按照功能和所參與的代謝過程分為:與心肌脂代謝有關的蛋白、與心肌線粒體有關的蛋白和與心肌病發(fā)生發(fā)展有關的蛋白，進一步明確這些重要蛋白在糖尿病心肌病變中的可能起的作用。
　　 7.PHL干預后差異蛋白的生物信息學分析
　　 對于PHL干預后的113個差異蛋白點，采用IPA軟件對有顯著改變的蛋白所參與的重要生物過程和疾病進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白所參與的生物過程和疾病包括心血管疾

21、病、脂代謝、心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自由基的修復和能量的產(chǎn)生等等，都是與糖尿病心肌病變的發(fā)展密切相關的生物過程。
　　 對于PHL干預后的113個差異蛋白點，采用IPA軟件繪制差異蛋白功能網(wǎng)絡來說明這些蛋白之間的相互關系。網(wǎng)絡中共出現(xiàn)35個蛋白，其中有24個蛋白是我們篩選出的重要的差異蛋白，比如Dapk3，Titin，Prkaa，Des，ILK，Nampt等。此蛋白相互作用網(wǎng)絡為我們進一步研究脂質(zhì)代謝、線粒體功能

22、和心肌病的發(fā)生和發(fā)展之間的關系提供了新的思路。
　　 8.篩選的差異蛋白在心肌組織的表達改變
　　 為了驗證蛋白質(zhì)組學鑒定出的部分差異蛋白在心肌組織的表達，應用Westernblot方法檢測其中差異蛋白如鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)與整合素連接激酶(integrin-linkedproteinkinase，ILK)在各組小鼠心肌組織中的表達。結果顯示，與在正常對照組小鼠心肌中的表達比較，Calnexin在db/db小鼠中

23、表達明顯增高，然而PHL治療后，表達增高的Calnexin有所下調(diào)。另外，ILK在db/db小鼠中表達中與正常對照組比較表達后明顯降低，經(jīng)過PHL干預后該蛋白表達回調(diào)。經(jīng)過VisionWorksLSimageacquisitionandanalysissoftware軟件分析亦顯示該蛋白質(zhì)印跡實驗結果與iTRAQ鑒定結果是一致的。
　　 結論
　　 1.與正常對照組比較，db/db小鼠隨年齡增長體重顯著增加，血FBG、T

24、G、TC及AGEs水平顯著升高;PHL灌胃干預可以明顯抑制db/db小鼠的肥胖趨勢，并且能夠顯著降低其FBG、TG、TC及與AGEs水平。說明PHL可能通過改善db/db小鼠的糖尿病整體代謝紊亂狀態(tài)來預防DM的進展和并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 2.心肌組織的形態(tài)學觀察顯示，PHL治療可以明顯改善db/db小鼠心肌組織肥大以及細胞核損傷的情況;而且，PHL治療明顯減輕db/db小鼠心肌細胞中肌原纖維的不規(guī)則排列情況，降低損傷的線粒體的數(shù)

25、量。說明PHL對db/db小鼠的糖尿病心肌病變具有保護作用。
　　 3.作為定量蛋白質(zhì)組學的新技術，iTRAQ具有高靈敏性、高通量，良好的定量效果、較高的重復性，能夠?qū)τ诙嘟M樣本同時進行比較分析以便獲得更好的蛋白質(zhì)組覆蓋率。所以，iTRAQ能夠用于研究PHL對db/db小鼠糖尿病心肌病變保護作用的分子機制，幫助發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標。
　　 4.應用LS-ESI-MS/MS鑒定得到db/db小鼠組與正常對照組心肌蛋白相比表達有

26、變化但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達蛋白共113個，其中在DM組表達上調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有29個，在DM組下調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有84個。采用IPA分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白參與的生物過程和疾病涉及到心血管疾病、脂代謝、心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自由基的修復和能量的產(chǎn)生等等，提示這些過程可能與糖尿病心肌病變的發(fā)生與發(fā)展密切相關。
　　 第二部分質(zhì)膜微囊的脂肪酸組成和小窩蛋白-1的脂肪酸化的研究
　　 研究

27、背景
　　 質(zhì)膜微囊(Caveolea)，是一種特殊類型的脂筏，是哺乳動物細胞質(zhì)膜上呈細頸燒瓶狀的內(nèi)陷結構，內(nèi)含豐富的膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂。質(zhì)膜微囊大量存在于內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、纖維母細胞和肺上皮細胞，參與許多細胞生命活動，細胞內(nèi)吞、膽固醇運輸、細胞膜組裝、信號傳導和腫瘤生成。小窩蛋白(caveolin)是質(zhì)膜微囊區(qū)別于其它脂筏結構的特征性蛋白分子，它與信號傳導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞增殖等密切相關，維持著質(zhì)膜微囊的結

28、構和功能。Caveolin-1能與多種信號分子如G蛋白僅亞基、酪氨酸激酶受體、PKCs、Src家族酪氨酸激酶和eNOS相互作用。生物體內(nèi)小窩蛋白異?？梢砸鸲喾N疾病或異常。
　　 除了富含膽固醇和鞘磷脂，caveolea內(nèi)也含有多種脂肪酸。一般認為，大多數(shù)細胞的蛋白質(zhì)脂肪酸化是以共價鍵形式與肉豆蔻酸(C14∶0)和/或棕櫚酸(C16∶0)結合，并且蛋白質(zhì)的脂肪酸化對其在細胞膜上的定位十分重要。從目前國內(nèi)外的研究情況來看，雖然ca

29、veolea的結構成分已經(jīng)較為清楚，但是對于其所含脂肪酸的種類組成與絕對定量的研究并不多見;此外，目前對于caveolea內(nèi)的許多蛋白質(zhì)（如eNOS）的脂肪酸化及功能研究報道諸多，但是作為caveolea的支架蛋白，有關caveolin-1的脂肪酸化及其在caveolea上定位的影響卻報道甚少。在本研究中，我們采用了氣相色譜-質(zhì)譜技術(GC/MS)來定性和定量中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中脂肪酸、caveolea內(nèi)含有的脂肪酸和以共價鍵形

30、式結合在caveolin-1上的脂肪酸，并用同位素標記的脂肪酸驗證了caveolin-1的脂肪酸化，以及觀察了caveolin-1的脂肪酸化對其在caveolae上的定位是否有影響，旨在明確特定脂肪酸與caveolea、caveolin-1的關系，為日后研究某種特定脂肪酸對蛋白質(zhì)的酸化作用奠定理論基礎。
　　 研究目的
　　 1.采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(GC/MS)對CHO細胞中脂肪酸、caveolea內(nèi)含有的脂肪酸和以

31、共價鍵形式結合在caveolin-1上的脂肪酸來進行定性和定量，旨在明確其相關脂肪酸組成及含量。
　　 2.采用同位素標記的脂肪酸，通過觀察與非標記脂肪酸競爭性結合caveolin-1，來驗證caveolin-1的脂肪酸化的種類。
　　 3.通過將CHO細胞培養(yǎng)在含有或不含有特定脂肪酸的環(huán)境中，觀察caveolin-1的脂肪酸化對其在caveolae上的定位是否有影響。
　　 研究方法
　　 中國倉鼠卵巢

32、(CHO)細胞在10cm的培養(yǎng)盤中使用Ham'sF-12培養(yǎng)基（含5％的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺，100U/mL的青霉素和100μg/ml的鏈霉素）培養(yǎng)至90％融合，用冷的PBS洗5遍后溶解于1mlMBST/OG（含25mM的MES，150mMNaCl，1％Triton-100，60mM心肌糖苷，PH=6.7），在冰上放置30分鐘。使用Opti-prep的方法將質(zhì)膜微囊(caveolea)、細胞質(zhì)(cytosol)、質(zhì)膜(p

33、lasmamembrane)、內(nèi)膜(internalmembrane)和去核后上清液(postnuclearsupernatan，PNS)分離。為了提取用于脂肪酸定量的caveolin-1，CHO細胞的裂解液中加入抗caveolin-1IgG在4℃孵育18小時，然后用蛋白A磁珠孵育另外2小時。離心，收集珠子，然后使用高鹽緩沖液(500mMNaCl)洗5次。用于定量分析的脂肪酸珠子用1M的NaOH孵育過夜，然后用1MHCl中和，再用Fol

34、ch試劑（氯仿∶甲醇=2∶1）提取脂質(zhì)，并用GC/MS分析。非免疫兔IgG被用作陰性對照。用GC/MS對脂肪酸進行定量方法是:用Folch/BHT試劑來提取樣本中的脂質(zhì)，50μl的二十三烷酸(23∶0)（5mg/ml的氯仿）加入提取液中作為內(nèi)參。然后樣本中全部的脂質(zhì)用BF3/甲醛(10％)進行甲基脂化。用裝有omegawax250毛細管柱的氣相色譜系統(tǒng)(Agilent6890GCG2579A)來分析脂肪酸甲基脂。大型選擇性探頭(MSD，

35、Agilent5973)用來識別目標峰，氫火焰離子化檢測器(FID)用于定量脂肪酸。蛋白質(zhì)印跡方法原理與步驟同第一部分。一抗為抗caveolin-1IgG多克隆抗體（滴度1∶200，Sigma，USA）。為了測定Caveolin-1的脂肪酸化，CHO細胞在10cm培養(yǎng)皿中使用Ham'sF-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至80％融合（含5％的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺，100U/mL的青霉素和100μg/ml的鏈霉素）。使用含1％BSA的培養(yǎng)

36、基饑餓細胞十八小時后，用2.5mCi的3H棕櫚酸(3H-C16∶0)或者25μCi的14C硬脂酸(14C-C18∶0)在有/無30倍濃度的非標記棕櫚酸和硬質(zhì)酸的培養(yǎng)基中室溫標記3小時。將細胞溶解于MBST/OG緩沖液，用抗caveolin-1/蛋白A免疫沉淀。非免疫兔IgG被用作陰性對照。免疫沉淀下來的caveolin-1用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，caveolin-1的脂肪酸化用自動放射性監(jiān)測儀檢測在-80℃存放6周，

37、用KodakMS膠卷顯影。
　　 研究結果
　　 1.CHO細胞中FA的含量及組成
　　 通過用GC/MS檢測CHO全細胞裂解液中的脂肪酸的種類及含量，我們發(fā)現(xiàn)CHO細胞中含有多種脂肪酸，包括飽和與不飽和脂肪。在這些脂肪酸中油酸占了高達59.5％的比例(C18∶1，307±18.4μg/5×107cells)，其次是棕櫚酸(C16∶0，91.8±9.5μg/5×107cells;17.8％)），硬脂酸(C18∶0

38、，51.8±10.2μg/5×107cells;10％)），鱈油酸(C20∶1，22.5±1.4μg/5×107cells;4.4％)，棕櫚油酸(C16∶1，18.7±1.1μg/5×107cells;3.6％)，花生四烯酸(C20∶4，14.8±1.8μg/5×107cells;2.9％)和肉豆蔻酸(C14∶0,9.0±1.4μg/5×107cells;1.7％)。
　　 2.Caveolae中FA的含量及組成
　　

39、通過用GC/MS檢測caveolea中脂肪酸的含量與組成，我們發(fā)現(xiàn)caveolea中含有有限的幾種脂肪酸，主要為棕櫚酸(C16∶0，0.48±0.06μg/5×107ells;24％)，硬脂酸(C18∶0，0.61土0.07μg/5×107cells;30％)和油酸(C18∶1，0.83±0.21μg/5×107cells;40％)。
　　 3.與Caveolin-1結合的FA的含量及組成
　　 一般認為，質(zhì)膜蛋白會容易

40、被肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚酸(C16∶0)所脂肪酸化。然而通過用GC/MS檢測與caveolin-1結合的脂肪酸含量與組成，我們發(fā)現(xiàn)約60％的與caveolin-1結合的脂肪酸為硬脂酸(C18∶0)，40％的為棕櫚酸(C16∶0)。我們并沒有沒有檢測到任何的肉豆蔻酸(C14∶0)與CHO細胞的caveolin-1相結合。
　　 4.測定Caveolin-1的脂肪酸化
　　 為了進一步驗證結合于caveolin-1上的

41、脂肪酸種類及相互作用，我們采用了同位素標記的脂肪酸來檢測Caveolin-1脂肪酸化。結果顯示，在用3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)標記的細胞中，我們檢測到了結合到caveolin-1上的大量3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)，說明棕櫚酸可以直接與caveolin-1相結合。當有過量的非標記棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)存在時，非標記棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)有效的阻滯了3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)與cav

42、eolin-1的結合。但是過量的非標記油酸(C18∶1)只是輕度的阻滯了3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)和caveolin-1的結合。
　　 同樣的，在用14-硬脂酸(14C-C18∶0)標記的細胞中，我們檢測到了與caveolin-1結合的大量14-硬脂酸，說明硬脂酸可以直接與caveolin-1相結合。當有過量的非標記硬脂酸(C18∶0)存在時，非標記硬脂酸(C18∶0)能夠有效地抑制14C-硬脂酸(14C-C18∶0)與c

43、aveolin-1的結合。過量的非標記油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)雖然也阻滯了14C-硬脂酸(14C-C18∶0)與caveolin-1的結合，但是阻滯的效果較之非標記硬脂酸(C18∶0)不明顯。
　　 這些數(shù)據(jù)說明棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)可以直接結合于caveolin-1上，并且是其結合的主要脂肪酸。
　　 5.脂肪酸化對Caveolin-1亞細胞定位的影響
　　 蛋白質(zhì)的脂肪酸化

44、可以影響蛋白的亞細胞定位。為了檢測caveolin-1的脂肪酸化是否影響了caveolin-1的亞細胞定位，我們把CHO細胞分別培養(yǎng)在含有20％FBS，1％BSA，1％BSA+棕櫚酸（過量）和1％BSA+硬脂酸（過量）培養(yǎng)基中。結果顯示，caveolin-1在caveolea上的定位在20％FBS與1％BSA培養(yǎng)基中沒有明顯差別，在加入和不加入過量棕櫚酸或硬脂酸培養(yǎng)基也未見明顯差別。說明棕櫚酸和硬脂酸對于caveolin-1在caveo

45、lea上的定位沒有明顯影響。
　　 結論
　　 Caveolea含有有限種類的部分脂肪酸，其中飽和脂肪酸的含量較高，這與CHO全細胞中脂肪酸的組成有所不同。與caveolin-1結合的最主要脂肪酸是硬脂酸，而不是之前推測的肉豆蔻酸。Caveolea獨特的脂肪酸結構和caveolin-1的脂肪酸化可能對于caveolea的形成和維持其功能非常重要。對這些相關脂肪酸的定性和定量研究將會對進一步揭示Caveolea的功能和ca