根皮苷對db-db小鼠糖尿病心肌病變保護(hù)機(jī)制的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第一部分根皮苷對db/db小鼠糖尿病心肌病變保護(hù)機(jī)制的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研究背景
　　 糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一種由于胰島素絕對或相對分泌不足而導(dǎo)致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的一種常見內(nèi)分泌代謝性疾病。近年來，DM的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類健康與生活質(zhì)量的世界性公告衛(wèi)生問題。DM不僅僅表現(xiàn)為長期慢性的血糖升高，還可伴有多種并發(fā)癥。其中心血管并

2、發(fā)癥已經(jīng)成為DM并發(fā)癥中致殘率和致死率最高、危害最大的并發(fā)癥。
　　 糖尿病性心臟病是糖尿病患者致死的主要原因之一，尤其是在2型糖尿病患者中。廣義的糖尿病心臟病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?，糖尿病心肌病變和糖尿病心臟自主神經(jīng)病變等。糖尿病心臟病與非糖尿病患者相比常起病比較早，糖尿病患者伴冠心病常表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，梗死面積比較大，穿壁梗死多，病情多比較嚴(yán)重，預(yù)后比較差，病死率較高;如冠狀動(dòng)脈造影和臨床排除冠狀動(dòng)脈病變

3、，糖尿病患者出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常心臟肥大肺淤血和充血性心力衰竭，尤其是難治性心力衰竭臨床可考慮糖尿病心肌病(DiabeticCardimyopathy,DCM)。DCM是指發(fā)生在DM中，不能用高血壓性心臟病、冠心病、心臟瓣膜病及其他心臟病來解釋的心肌疾病。這一疾病在代謝紊亂及微血管病變的基礎(chǔ)上引發(fā)心肌廣泛灶性壞死，出現(xiàn)亞臨床心功能異常，最終進(jìn)展為心律失常、心力衰竭及心源性休克。迄今為止，針對糖尿病引起的心肌損傷目前尚無特效療法，臨床治療首

4、先是控制DM，然后主要針對心肌損害、心律失常、心力衰竭和抗血栓進(jìn)行治療。而且由于部分患者早期并無明顯癥狀，而上述治療方法均存在一定局限性，并不能有效及時(shí)的阻止它的的發(fā)展。因此，在臨床實(shí)踐中迫切需要尋找能有效防治糖尿病心肌病變的新型藥物與途徑，進(jìn)一步完善與充實(shí)糖尿病心肌病變的治療策略。
　　 根皮苷(phlorizin，PHL)是根皮素(phloretin)的2'-β-D-葡萄糖苷，是從蘋果，蘋果樹皮及葉中提取的一種二氫查爾酮苷。

5、大量研究表明，PHL具有多種生物活性與藥理作用，如調(diào)節(jié)血糖、抗炎、抗腫瘤、改善認(rèn)知以及抗氧化等等，目前已被應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域。近年來，PHL作為新型藥物在防治DM及其并發(fā)癥中的作用獲得廣泛關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期口服PHL對DM并發(fā)癥的靶器官如腎臟、心臟、大動(dòng)脈和視網(wǎng)膜的病變都起到顯著地保護(hù)和改善作用。雖然臨床研究已經(jīng)證實(shí)了PHL對于DM患者心臟的保護(hù)作用，但是PHL對糖尿病心肌病變的改善及其保護(hù)作用的可能機(jī)制，目前國內(nèi)外鮮

6、見報(bào)道;PHL治療糖尿病心肌病變的作用分子靶點(diǎn)也尚未明確。
　　 同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)，具有良好的定量效果、較高的重復(fù)性，并可對多達(dá)四種不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析。目前，iTRAQ技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究中得到了極其廣泛的應(yīng)用。但是，國內(nèi)外尚無報(bào)道采用iTRAQ標(biāo)

7、記及相關(guān)分析技術(shù)來研究根皮苷對2型糖尿病心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　 因此，在本研究中，我們應(yīng)用了目前較為普遍認(rèn)可的db/db小鼠的2型DM動(dòng)物模型，通過10周的PHL灌胃，觀察PHL對于db/db小鼠體重、血糖、血脂、血膽固醇及血中AGEs水平的影響，并對db/db小鼠的心臟進(jìn)行了組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察，旨在觀察天然藥物PHL治療對于db/db小鼠體重、DM有關(guān)代謝指標(biāo)的影響及其對心臟的保護(hù)作用，為臨床治療糖尿病性心臟

8、病提供新的治療思路與途徑。另外，我們還應(yīng)用了iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，TurboSEQUEST軟件和國際蛋白質(zhì)索引(internationalproteinindex，IPI)數(shù)據(jù)庫檢索等生物信息學(xué)方法，分離與鑒定正常對照組（CC組），db/db小鼠組（DM組）與db/db小鼠PHL治療組（DMT組）等小鼠心肌組織的差異表達(dá)蛋白，旨在揭示PHL對于db/db小鼠糖尿病心肌病變變的分子保護(hù)機(jī)制，為開展藥物研發(fā)工作、尋找新的藥物靶標(biāo)開辟

9、新途徑，為臨治療提供新的思路。
　　 研究目的
　　 1.研究db/db小鼠在糖尿病進(jìn)展中體重及有關(guān)代謝指標(biāo)的變化，通過對db/db小鼠的心臟組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察，評價(jià)糖尿病心肌病變的特征與程度。初步探討db/db小鼠糖尿病心肌病變的差異表達(dá)蛋白的特征，進(jìn)一步了解糖尿病心肌病變的分子機(jī)制。
　　 2.研究PHL對db/db小鼠體重及糖尿病有關(guān)代謝指標(biāo)的變化的影響，通過對db/db小鼠的心臟組織病理學(xué)和

10、超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察，評價(jià)PHL對糖尿病心肌病變的保護(hù)作用。探討db/db小鼠經(jīng)PHL治療后心肌組織的差異表達(dá)蛋白，根據(jù)其所參與的生物過程和代謝通路篩選出藥物作用的關(guān)鍵蛋白與候選靶標(biāo)，進(jìn)一步揭示PHL對于糖尿病心肌病變的保護(hù)機(jī)制，為臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 7周齡的雄性C57BLKS/Jdb/db小鼠16只，以及7周齡雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠8只。小鼠均予觀察1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。用C57

11、BLKS/Jdb/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，C57BLKS/Jdb/db小鼠分為兩組:一組隨機(jī)8只小鼠為DM模型組(DM)，每日用生理鹽水灌胃;另一組隨機(jī)8只為PHL干預(yù)組(DMT)，每日用體積相同生理鹽水的20mg/kg/d的PHL溶液灌胃，干預(yù)時(shí)間為10周。實(shí)驗(yàn)期間每周定期測量每只小鼠的體重并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠空腹過夜并處死，采血檢測空腹血糖(FBG)，血甘油三酯(TG)，血總膽固醇(TC)及血清糖基化終末代謝產(chǎn)物(

12、AGEs)等指標(biāo);并迅速分離心臟組織，按照病理取材常規(guī)制作心肌石蠟切片。剩余心臟組織分離后立即存于液氮-80℃保存留待進(jìn)一步蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)用。
　　 從正常對照組（CC組），db/db小鼠組（DM組）與db/db小鼠PHL治療組（DMT組）三組小鼠中各選取4只，分離心臟。每只小鼠取50mg心臟組織，進(jìn)行心肌組織研磨、切碎、超聲破碎、裂解來提取心肌總蛋白。各組取60ug肽段消化后用iTRAQ染料進(jìn)行標(biāo)記，正常對照組用114標(biāo)記，P

13、HL干預(yù)組用116標(biāo)記，db/db糖尿病組用117則標(biāo)記。將各組已標(biāo)記的肽段混合，用強(qiáng)陽離子交換柱(strongcationexchange，SCX)進(jìn)行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并成10組。接下來用ThermoFinniganLTQVelos質(zhì)譜儀進(jìn)行液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)。最后，使用相關(guān)軟件將定量及檢定結(jié)果進(jìn)行合并處理，得到定量和鑒定結(jié)果。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為ipi.MOUSE.v3.72.REVER

14、SED.fasta蛋白庫（Sequest結(jié)果過濾參數(shù)為:ProteinFDR≤0.01;PeptideFDR≤0.01），應(yīng)用EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)工具來分析等電點(diǎn)、分子量等。然后采用IngenuityPathwayAnalysis軟件(www.ingenuity.com)對經(jīng)鑒定的心肌蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白功能和通路的分析。最后將篩選出的部分差異蛋白用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Westernblot)進(jìn)一步驗(yàn)證其在心肌組織中的表達(dá)。
　　

15、研究結(jié)果
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長良好，精神狀況佳，毛發(fā)光亮順澤，活躍。DM組小鼠在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，逐漸表現(xiàn)為毛發(fā)污穢無光澤，被毛蓬松，少動(dòng)，出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿，體重迅速增加。而DMT組小鼠的上述表現(xiàn)較DM組有所減輕。
　　 2.PHL對db/d小鼠體重、FBG、TG、TC與AGEs的影響
　　 隨著觀察時(shí)間的延長，DM組與DMT組小鼠的體重較對照組呈顯著增加。從實(shí)驗(yàn)第2周開始，DM組

16、小鼠體重逐漸增加，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第10周(P＜0.05)。然而，DMT組小鼠與DM組相比，PHL灌胃顯著改善了DM小鼠體重的快速增加(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組小鼠的血FBG、TG、TC及AGES水平無明顯差異。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)DM組小鼠的FBG、TG、TC及AGES水平與CC組比較，均明顯升高(P＜0.05)。給予PHL干預(yù)的DMT組小鼠的FBG、TG、TC及與AGES水平與DM組比較則明顯下降(P＜0.05)

17、。
　　 3.PHL對db/db小鼠心肌組織病理學(xué)變化的影響
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將db/db小鼠心肌組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)行觀察。DM組的小鼠的心肌組織較CC組呈現(xiàn)出明顯的心肌細(xì)胞肥大和心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，并伴有細(xì)胞核損傷。然而，DMT組經(jīng)過PHL的治療大大減少了心肌組織肥大以及細(xì)胞核損傷的情況。
　　 4.PHL對db/db小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響
　　 通過電子顯微鏡下對db/d

18、b小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)CC組小鼠心肌細(xì)胞肌原纖維完整，排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)正常，呈線性排列;細(xì)胞核形態(tài)良好，核膜完整。而DM組心肌細(xì)胞中可以觀察到線粒體腫脹，嵴溶解，有很大區(qū)域的肌原纖維及線粒體排列混亂不規(guī)則;細(xì)胞核的形態(tài)有所改變，核膜不完整。然而，在DMT組，PHL的治療明顯的降低了心肌細(xì)胞中損傷的線粒體的數(shù)量，并且減輕了肌原纖維的不規(guī)則排列情況。
　　 5.iTRAQ鑒定結(jié)果
　　 經(jīng)LS-ESI-MS/

19、MS鑒定并予軟件分析、數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出蛋白1627種，符合鑒定條件者可信蛋白1591中，具有唯一肽段7836個(gè)。其中鑒定在DM組與正常對照組心肌蛋白相比表達(dá)有變化但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達(dá)蛋白共113個(gè)，其中在DM組表達(dá)上調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有29個(gè)，在DM組表達(dá)下調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有84個(gè)。
　　 6.PHL干預(yù)后重要差異蛋白質(zhì)特征
　　 在這些經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達(dá)蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)一些涉

20、及到糖尿病心肌病變發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，并把它們按照功能和所參與的代謝過程分為:與心肌脂代謝有關(guān)的蛋白、與心肌線粒體有關(guān)的蛋白和與心肌病發(fā)生發(fā)展有關(guān)的蛋白，進(jìn)一步明確這些重要蛋白在糖尿病心肌病變中的可能起的作用。
　　 7.PHL干預(yù)后差異蛋白的生物信息學(xué)分析
　　 對于PHL干預(yù)后的113個(gè)差異蛋白點(diǎn)，采用IPA軟件對有顯著改變的蛋白所參與的重要生物過程和疾病進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白所參與的生物過程和疾病包括心血管疾

21、病、脂代謝、心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自由基的修復(fù)和能量的產(chǎn)生等等，都是與糖尿病心肌病變的發(fā)展密切相關(guān)的生物過程。
　　 對于PHL干預(yù)后的113個(gè)差異蛋白點(diǎn)，采用IPA軟件繪制差異蛋白功能網(wǎng)絡(luò)來說明這些蛋白之間的相互關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中共出現(xiàn)35個(gè)蛋白，其中有24個(gè)蛋白是我們篩選出的重要的差異蛋白，比如Dapk3，Titin，Prkaa，Des，ILK，Nampt等。此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為我們進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝、線粒體功能

22、和心肌病的發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系提供了新的思路。
　　 8.篩選的差異蛋白在心肌組織的表達(dá)改變
　　 為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出的部分差異蛋白在心肌組織的表達(dá)，應(yīng)用Westernblot方法檢測其中差異蛋白如鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)與整合素連接激酶(integrin-linkedproteinkinase，ILK)在各組小鼠心肌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與在正常對照組小鼠心肌中的表達(dá)比較，Calnexin在db/db小鼠中

23、表達(dá)明顯增高，然而PHL治療后，表達(dá)增高的Calnexin有所下調(diào)。另外，ILK在db/db小鼠中表達(dá)中與正常對照組比較表達(dá)后明顯降低，經(jīng)過PHL干預(yù)后該蛋白表達(dá)回調(diào)。經(jīng)過VisionWorksLSimageacquisitionandanalysissoftware軟件分析亦顯示該蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與iTRAQ鑒定結(jié)果是一致的。
　　 結(jié)論
　　 1.與正常對照組比較，db/db小鼠隨年齡增長體重顯著增加，血FBG、T

24、G、TC及AGEs水平顯著升高;PHL灌胃干預(yù)可以明顯抑制db/db小鼠的肥胖趨勢，并且能夠顯著降低其FBG、TG、TC及與AGEs水平。說明PHL可能通過改善db/db小鼠的糖尿病整體代謝紊亂狀態(tài)來預(yù)防DM的進(jìn)展和并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 2.心肌組織的形態(tài)學(xué)觀察顯示，PHL治療可以明顯改善db/db小鼠心肌組織肥大以及細(xì)胞核損傷的情況;而且，PHL治療明顯減輕db/db小鼠心肌細(xì)胞中肌原纖維的不規(guī)則排列情況，降低損傷的線粒體的數(shù)

25、量。說明PHL對db/db小鼠的糖尿病心肌病變具有保護(hù)作用。
　　 3.作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)，iTRAQ具有高靈敏性、高通量，良好的定量效果、較高的重復(fù)性，能夠?qū)τ诙嘟M樣本同時(shí)進(jìn)行比較分析以便獲得更好的蛋白質(zhì)組覆蓋率。所以，iTRAQ能夠用于研究PHL對db/db小鼠糖尿病心肌病變保護(hù)作用的分子機(jī)制，幫助發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。
　　 4.應(yīng)用LS-ESI-MS/MS鑒定得到db/db小鼠組與正常對照組心肌蛋白相比表達(dá)有

26、變化但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的差異表達(dá)蛋白共113個(gè)，其中在DM組表達(dá)上調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有29個(gè)，在DM組下調(diào)的但經(jīng)PHL治療后回調(diào)的有84個(gè)。采用IPA分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白參與的生物過程和疾病涉及到心血管疾病、脂代謝、心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自由基的修復(fù)和能量的產(chǎn)生等等，提示這些過程可能與糖尿病心肌病變的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第二部分質(zhì)膜微囊的脂肪酸組成和小窩蛋白-1的脂肪酸化的研究
　　 研究

27、背景
　　 質(zhì)膜微囊(Caveolea)，是一種特殊類型的脂筏，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上呈細(xì)頸燒瓶狀的內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂。質(zhì)膜微囊大量存在于內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞，參與許多細(xì)胞生命活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)吞、膽固醇運(yùn)輸、細(xì)胞膜組裝、信號傳導(dǎo)和腫瘤生成。小窩蛋白(caveolin)是質(zhì)膜微囊區(qū)別于其它脂筏結(jié)構(gòu)的特征性蛋白分子，它與信號傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖等密切相關(guān)，維持著質(zhì)膜微囊的結(jié)

28、構(gòu)和功能。Caveolin-1能與多種信號分子如G蛋白僅亞基、酪氨酸激酶受體、PKCs、Src家族酪氨酸激酶和eNOS相互作用。生物體內(nèi)小窩蛋白異常可以引起多種疾病或異常。
　　 除了富含膽固醇和鞘磷脂，caveolea內(nèi)也含有多種脂肪酸。一般認(rèn)為，大多數(shù)細(xì)胞的蛋白質(zhì)脂肪酸化是以共價(jià)鍵形式與肉豆蔻酸(C14∶0)和/或棕櫚酸(C16∶0)結(jié)合，并且蛋白質(zhì)的脂肪酸化對其在細(xì)胞膜上的定位十分重要。從目前國內(nèi)外的研究情況來看，雖然ca

29、veolea的結(jié)構(gòu)成分已經(jīng)較為清楚，但是對于其所含脂肪酸的種類組成與絕對定量的研究并不多見;此外，目前對于caveolea內(nèi)的許多蛋白質(zhì)（如eNOS）的脂肪酸化及功能研究報(bào)道諸多，但是作為caveolea的支架蛋白，有關(guān)caveolin-1的脂肪酸化及其在caveolea上定位的影響卻報(bào)道甚少。在本研究中，我們采用了氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC/MS)來定性和定量中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中脂肪酸、caveolea內(nèi)含有的脂肪酸和以共價(jià)鍵形

30、式結(jié)合在caveolin-1上的脂肪酸，并用同位素標(biāo)記的脂肪酸驗(yàn)證了caveolin-1的脂肪酸化，以及觀察了caveolin-1的脂肪酸化對其在caveolae上的定位是否有影響，旨在明確特定脂肪酸與caveolea、caveolin-1的關(guān)系，為日后研究某種特定脂肪酸對蛋白質(zhì)的酸化作用奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的
　　 1.采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC/MS)對CHO細(xì)胞中脂肪酸、caveolea內(nèi)含有的脂肪酸和以

31、共價(jià)鍵形式結(jié)合在caveolin-1上的脂肪酸來進(jìn)行定性和定量，旨在明確其相關(guān)脂肪酸組成及含量。
　　 2.采用同位素標(biāo)記的脂肪酸，通過觀察與非標(biāo)記脂肪酸競爭性結(jié)合caveolin-1，來驗(yàn)證caveolin-1的脂肪酸化的種類。
　　 3.通過將CHO細(xì)胞培養(yǎng)在含有或不含有特定脂肪酸的環(huán)境中，觀察caveolin-1的脂肪酸化對其在caveolae上的定位是否有影響。
　　 研究方法
　　 中國倉鼠卵巢

32、(CHO)細(xì)胞在10cm的培養(yǎng)盤中使用Ham'sF-12培養(yǎng)基（含5％的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺，100U/mL的青霉素和100μg/ml的鏈霉素）培養(yǎng)至90％融合，用冷的PBS洗5遍后溶解于1mlMBST/OG（含25mM的MES，150mMNaCl，1％Triton-100，60mM心肌糖苷，PH=6.7），在冰上放置30分鐘。使用Opti-prep的方法將質(zhì)膜微囊(caveolea)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol)、質(zhì)膜(p

33、lasmamembrane)、內(nèi)膜(internalmembrane)和去核后上清液(postnuclearsupernatan，PNS)分離。為了提取用于脂肪酸定量的caveolin-1，CHO細(xì)胞的裂解液中加入抗caveolin-1IgG在4℃孵育18小時(shí)，然后用蛋白A磁珠孵育另外2小時(shí)。離心，收集珠子，然后使用高鹽緩沖液(500mMNaCl)洗5次。用于定量分析的脂肪酸珠子用1M的NaOH孵育過夜，然后用1MHCl中和，再用Fol

34、ch試劑（氯仿∶甲醇=2∶1）提取脂質(zhì)，并用GC/MS分析。非免疫兔IgG被用作陰性對照。用GC/MS對脂肪酸進(jìn)行定量方法是:用Folch/BHT試劑來提取樣本中的脂質(zhì)，50μl的二十三烷酸(23∶0)（5mg/ml的氯仿）加入提取液中作為內(nèi)參。然后樣本中全部的脂質(zhì)用BF3/甲醛(10％)進(jìn)行甲基脂化。用裝有omegawax250毛細(xì)管柱的氣相色譜系統(tǒng)(Agilent6890GCG2579A)來分析脂肪酸甲基脂。大型選擇性探頭(MSD，

35、Agilent5973)用來識別目標(biāo)峰，氫火焰離子化檢測器(FID)用于定量脂肪酸。蛋白質(zhì)印跡方法原理與步驟同第一部分。一抗為抗caveolin-1IgG多克隆抗體（滴度1∶200，Sigma，USA）。為了測定Caveolin-1的脂肪酸化，CHO細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中使用Ham'sF-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至80％融合（含5％的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺，100U/mL的青霉素和100μg/ml的鏈霉素）。使用含1％BSA的培養(yǎng)

36、基饑餓細(xì)胞十八小時(shí)后，用2.5mCi的3H棕櫚酸(3H-C16∶0)或者25μCi的14C硬脂酸(14C-C18∶0)在有/無30倍濃度的非標(biāo)記棕櫚酸和硬質(zhì)酸的培養(yǎng)基中室溫標(biāo)記3小時(shí)。將細(xì)胞溶解于MBST/OG緩沖液，用抗caveolin-1/蛋白A免疫沉淀。非免疫兔IgG被用作陰性對照。免疫沉淀下來的caveolin-1用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，caveolin-1的脂肪酸化用自動(dòng)放射性監(jiān)測儀檢測在-80℃存放6周，

37、用KodakMS膠卷顯影。
　　 研究結(jié)果
　　 1.CHO細(xì)胞中FA的含量及組成
　　 通過用GC/MS檢測CHO全細(xì)胞裂解液中的脂肪酸的種類及含量，我們發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞中含有多種脂肪酸，包括飽和與不飽和脂肪。在這些脂肪酸中油酸占了高達(dá)59.5％的比例(C18∶1，307±18.4μg/5×107cells)，其次是棕櫚酸(C16∶0，91.8±9.5μg/5×107cells;17.8％)），硬脂酸(C18∶0

38、，51.8±10.2μg/5×107cells;10％)），鱈油酸(C20∶1，22.5±1.4μg/5×107cells;4.4％)，棕櫚油酸(C16∶1，18.7±1.1μg/5×107cells;3.6％)，花生四烯酸(C20∶4，14.8±1.8μg/5×107cells;2.9％)和肉豆蔻酸(C14∶0,9.0±1.4μg/5×107cells;1.7％)。
　　 2.Caveolae中FA的含量及組成
　　

39、通過用GC/MS檢測caveolea中脂肪酸的含量與組成，我們發(fā)現(xiàn)caveolea中含有有限的幾種脂肪酸，主要為棕櫚酸(C16∶0，0.48±0.06μg/5×107ells;24％)，硬脂酸(C18∶0，0.61土0.07μg/5×107cells;30％)和油酸(C18∶1，0.83±0.21μg/5×107cells;40％)。
　　 3.與Caveolin-1結(jié)合的FA的含量及組成
　　 一般認(rèn)為，質(zhì)膜蛋白會容易

40、被肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚酸(C16∶0)所脂肪酸化。然而通過用GC/MS檢測與caveolin-1結(jié)合的脂肪酸含量與組成，我們發(fā)現(xiàn)約60％的與caveolin-1結(jié)合的脂肪酸為硬脂酸(C18∶0)，40％的為棕櫚酸(C16∶0)。我們并沒有沒有檢測到任何的肉豆蔻酸(C14∶0)與CHO細(xì)胞的caveolin-1相結(jié)合。
　　 4.測定Caveolin-1的脂肪酸化
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合于caveolin-1上的

41、脂肪酸種類及相互作用，我們采用了同位素標(biāo)記的脂肪酸來檢測Caveolin-1脂肪酸化。結(jié)果顯示，在用3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)標(biāo)記的細(xì)胞中，我們檢測到了結(jié)合到caveolin-1上的大量3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)，說明棕櫚酸可以直接與caveolin-1相結(jié)合。當(dāng)有過量的非標(biāo)記棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)存在時(shí)，非標(biāo)記棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)有效的阻滯了3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)與cav

42、eolin-1的結(jié)合。但是過量的非標(biāo)記油酸(C18∶1)只是輕度的阻滯了3H-棕櫚酸(3H-C16∶0)和caveolin-1的結(jié)合。
　　 同樣的，在用14-硬脂酸(14C-C18∶0)標(biāo)記的細(xì)胞中，我們檢測到了與caveolin-1結(jié)合的大量14-硬脂酸，說明硬脂酸可以直接與caveolin-1相結(jié)合。當(dāng)有過量的非標(biāo)記硬脂酸(C18∶0)存在時(shí)，非標(biāo)記硬脂酸(C18∶0)能夠有效地抑制14C-硬脂酸(14C-C18∶0)與c

43、aveolin-1的結(jié)合。過量的非標(biāo)記油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)雖然也阻滯了14C-硬脂酸(14C-C18∶0)與caveolin-1的結(jié)合，但是阻滯的效果較之非標(biāo)記硬脂酸(C18∶0)不明顯。
　　 這些數(shù)據(jù)說明棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)可以直接結(jié)合于caveolin-1上，并且是其結(jié)合的主要脂肪酸。
　　 5.脂肪酸化對Caveolin-1亞細(xì)胞定位的影響
　　 蛋白質(zhì)的脂肪酸化

44、可以影響蛋白的亞細(xì)胞定位。為了檢測caveolin-1的脂肪酸化是否影響了caveolin-1的亞細(xì)胞定位，我們把CHO細(xì)胞分別培養(yǎng)在含有20％FBS，1％BSA，1％BSA+棕櫚酸（過量）和1％BSA+硬脂酸（過量）培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示，caveolin-1在caveolea上的定位在20％FBS與1％BSA培養(yǎng)基中沒有明顯差別，在加入和不加入過量棕櫚酸或硬脂酸培養(yǎng)基也未見明顯差別。說明棕櫚酸和硬脂酸對于caveolin-1在caveo

45、lea上的定位沒有明顯影響。
　　 結(jié)論
　　 Caveolea含有有限種類的部分脂肪酸，其中飽和脂肪酸的含量較高，這與CHO全細(xì)胞中脂肪酸的組成有所不同。與caveolin-1結(jié)合的最主要脂肪酸是硬脂酸，而不是之前推測的肉豆蔻酸。Caveolea獨(dú)特的脂肪酸結(jié)構(gòu)和caveolin-1的脂肪酸化可能對于caveolea的形成和維持其功能非常重要。對這些相關(guān)脂肪酸的定性和定量研究將會對進(jìn)一步揭示Caveolea的功能和ca