X盒結(jié)合蛋白1在糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病心肌?。╠iabeticcardiomyopathy，DCM）被認(rèn)為是一種與糖尿病(diabetesmellitus，DM)相關(guān)的心肌結(jié)構(gòu)改變及功能異常，于1972年由Rubler等首次提出。臨床上，DCM通常表現(xiàn)為進(jìn)行性左室肥厚及收縮和舒張功能障礙，其病理特點為心肌細(xì)胞肥大、凋亡，微血管病變及間質(zhì)纖維化等。DCM是一個長期而復(fù)雜的病理過程，它可以造成細(xì)胞代謝異常，進(jìn)一步損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、肌原纖維等細(xì)胞

2、器，并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和凋亡的增加。而作為一種可調(diào)節(jié)的、耗能的細(xì)胞自殺機(jī)制，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加又進(jìn)一步加重了DCM過程中的心肌重構(gòu)與功能障礙。
　　 細(xì)胞凋亡本質(zhì)上是一種細(xì)胞的程序性死亡，它是指當(dāng)機(jī)體處于生理或病理條件下，細(xì)胞啟動自身內(nèi)部機(jī)制，經(jīng)過多途徑的信號傳導(dǎo)，結(jié)束其自身生命的過程。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖相輔相成，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞群體的自我更新，維持機(jī)體的協(xié)調(diào)與平衡，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在DCM的發(fā)病過程中，雖然疾病早期即存

3、在著心肌細(xì)胞的肥大、增殖和凋亡，但心臟功能尚可維持正常。隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，細(xì)胞凋亡的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了細(xì)胞增殖的速度，心肌細(xì)胞失去正常的調(diào)控，使得凋亡的范圍增大，速度加快，組織細(xì)胞大量喪失，最終導(dǎo)致心功能嚴(yán)重減退。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制包括一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，這其中最為重要的就是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease，caspase)相關(guān)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

4、，包括死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路，線粒體/細(xì)胞色素c介導(dǎo)的凋亡通路和新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)介導(dǎo)的凋亡通路。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)一種極為重要的細(xì)胞器，其主要功能包括脂質(zhì)合成，蛋白質(zhì)折疊及鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。真核動物細(xì)胞中的大多數(shù)分泌蛋白和膜蛋白均需轉(zhuǎn)位至ER腔內(nèi)進(jìn)行修飾和折疊。氧化應(yīng)激、缺血、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡等諸多因素均可影響ER

5、的功能，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白的蓄積，這一過程被稱之為ERS。ERS可進(jìn)一步激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldingproteinresponse，UPR)，早期表現(xiàn)為抑制蛋白質(zhì)的翻譯和轉(zhuǎn)運，促進(jìn)分子伴侶的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ER-associateddegradation，ERAD），即將未折疊或錯誤折疊的蛋白逆轉(zhuǎn)回胞質(zhì)中，通過蛋白酶進(jìn)行降解，以減少未折疊或錯誤折疊蛋白在ER的積聚，維持ER的正常功能。然而，當(dāng)長期持續(xù)的應(yīng)激或

6、刺激強(qiáng)度超過ER自身處理能力時，UPR便會啟動細(xì)胞凋亡信號，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而過度的凋亡使得機(jī)體細(xì)胞大量喪失，最終導(dǎo)致器官功能障礙。因此，ERS如同一把雙刃劍，在疾病的初始階段，它的激活可以促使細(xì)胞存活，延緩器官功能的損害;然而隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，若ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡失去了正常調(diào)控，便將導(dǎo)致組織細(xì)胞的過度丟失，加速器官功能的衰竭。
　　 X盒結(jié)合蛋白l(X-boxbindingprotein1，XBP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的與

7、蛋白折疊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)建相關(guān)的蛋白質(zhì)。它是亮氨酸拉鏈蛋白家族中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠與主要組織相容性復(fù)合物基因啟動子區(qū)域的X盒順式作用元件相結(jié)合，是ERS反應(yīng)的關(guān)鍵信號調(diào)控因子。在ERS反應(yīng)過程中，XBPlmRNA經(jīng)過需肌醇酶1(inositol-requiringkinase1，IREl)依賴性的剪接，使得具有261個氨基酸的未剪接型XBPl(X-boxbindingprotein-1unsplicing，XBP1-u)轉(zhuǎn)錄激活形成由3

8、76個氨基酸構(gòu)成的剪接型XBPl(X-boxbindingprotein-1splicing，XBP1-s)。XBP1-s所調(diào)控的ERS在疾病初期通常可以促進(jìn)細(xì)胞的生存，然而，隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，ERS長期持續(xù)激活最終將導(dǎo)致組織細(xì)胞過度凋亡。
　　 在DCM的病程中，高血糖、氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等因素均可誘發(fā)ERS，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。然而，在這一病程中ERS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未明確，XBP1在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平如

9、何，XBP1是否能夠通過介導(dǎo)ERS的激活參與心肌細(xì)胞的凋亡并發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，這一系列問題目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)的研究。
　　 纈沙坦是一種選擇性AT1受體拮抗劑，在臨床上被廣泛地應(yīng)用于降低血壓和治療其他AngⅡ引起的心血管事件。近期研究表明纈沙坦除了具有降壓作用之外，還能夠通過增加血糖利用，降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖水平。因此，本研究擬采用纈沙坦干預(yù)DCM大鼠，探討其改善DCM心

10、肌重構(gòu)的作用，并進(jìn)一步研究纈沙坦的心肌保護(hù)作用與ERS的重要調(diào)控因子XBP1之間的聯(lián)系，旨在為臨床上DCM的防治提供全新的治療靶點和堅實的理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.構(gòu)建糖尿病大鼠模型，驗證DCM心肌重構(gòu)過程中存在ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的增加。
　　 2.探討DCM大鼠模型心肌組織中是否存在著XBP1的激活。
　　 3.探討XBP1與DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系。
　　 4.明確

11、纈沙坦逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，尤其是抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用與XBP1表達(dá)水平之間的聯(lián)系。
　　 研究方法：
　　 1.DCM動物模型的構(gòu)建
　　 第一階段:8周齡雄性Wistar大鼠(體重260～280g)50只，以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。隨后，隨機(jī)分為兩組:正常對照組10只，糖尿病組40只。糖尿病組大鼠腹腔注射STZ65mg/kg，正常對照組大鼠腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)。STZ腹腔注射7天后，收

12、集大鼠尾靜脈血測空腹血糖，以篩選成模糖尿病大鼠。糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L（300mg/dl）。未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除。
　　 第二階段:將已達(dá)糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)大鼠隨機(jī)分為2組:DCM組和DCM+纈沙坦組（30mg/kg/d）。正常對照組及DCM組大鼠予以生理鹽水灌胃。3組大鼠均再繼續(xù)喂養(yǎng)16周后處死取材。
　　 2.各組大鼠基本指標(biāo)的監(jiān)測
　　 實驗過程中除常規(guī)每2周測1次體重和血

13、壓，每4周測1次空腹血糖外，分別于STZ注射后7日及實驗?zāi)┏槿】崭刮察o脈血測定空腹血糖水平。
　　 3.超聲心動圖檢測
　　 分別于實驗開始時以及實驗?zāi)Ω鹘M進(jìn)行常規(guī)超聲心動圖檢查，主要檢測以下指標(biāo):心率、左室舒張末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimensiondiastole，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimensionsystole，LVI

14、Ds)、左室射血分?jǐn)?shù)（leftventricularejectionfraction，LVEF）、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時間(Edecelerationtime，EDT)、舒張末期左室后壁厚度（leftventricularposteriorwall，LVPW）、舒張末期室間隔厚度(interventricularseptumthickness，IVST)、短軸縮短率(fractionalshortening，

15、FS)、等容舒張時間(isovolumicrelaxationtime，IVRT)。
　　 4.心肌組織病理學(xué)檢測
　　 實驗結(jié)束處死動物后，進(jìn)行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)H&E染色、Masson三色染色以及天狼星紅染色，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、膠原分布情況。
　　 5.TUNEL染色
　　 使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（熒光法）對石蠟切片進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀

16、察，細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光的心肌細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 6.組織免疫熒光染色
　　 取心肌組織石蠟切片，對ERS標(biāo)志性分子GRP78進(jìn)行免疫熒光染色以證實ERS的發(fā)生。
　　 7.Westernblot檢測
　　 取-80℃保存的心肌組織，分別提取總蛋白和細(xì)胞核蛋白，通過10％～15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodeeylsulfatepolyacrylamidegelel

17、ectrophoresis，SDS-PAGE)對等量的蛋白樣品進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗標(biāo)記、顯色等，檢測分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulatedprotein78，GRP78）、C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein，CHOP)、XBPI-s、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53upregulatedmodulatorofapoptosis，Puma)、cleavedcaspase3和cyt

18、ochromec的表達(dá)。
　　 8.半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測
　　 Trizol法提取心肌組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得eDNA，以β-actin為參照，通過半定量RT-PCR技術(shù)檢測XBP1-smRNA水平的表達(dá)，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測GRP78及CHOP的mRNA表達(dá)水平。
　　 9.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所用數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示

19、，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.實驗動物的基本情況
　　 實驗第一階段，糖尿病造模組中3只大鼠未達(dá)糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)，予以剔除，剩余37只大鼠達(dá)到糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)入實驗下一階段。正常對照組狀態(tài)良好。實驗第二階段，5只罹患糖尿病的大鼠死亡，死亡原因可能與感染、糖尿病酮癥酸中毒及其他并發(fā)癥有關(guān)。最終共42

20、只大鼠完成實驗，其中正常對照組10只，DCM組15只，DCM+纈沙坦組17只。
　　 實驗過程中，正常對照組(n=10)大鼠精神狀態(tài)良好，體重明顯增加，反應(yīng)敏捷，毛色白而光澤。DCM組(n=15)大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食和消瘦（三多一少）癥狀，體重增加遲緩甚至下降，精神萎靡，皮毛臟亂無光澤。DCM+纈沙坦治療組(n=17)大鼠一般狀態(tài)較DCM組相對略好。
　　 2.各組大鼠的基本指標(biāo)監(jiān)測
　　 實驗初各組大鼠心率

21、、血糖、體重和血壓均無明顯差異(P＞0.05)。DCM大鼠自成模后多次測血糖，證明血糖水平始終維持在16.7mmol/L以上。實驗?zāi)〥CM組與正常對照組相比，心率和體重隨著喂養(yǎng)時間的延長而明顯下降，血壓則隨著喂養(yǎng)時間的延長而升高(P＜0.05);DCM+纈沙坦組大鼠血糖和血壓較DCM組有所下降，心率及體重增加(P＜0.05)。
　　 3.超聲心動圖檢測
　　 分別于實驗初和實驗?zāi)┩ㄟ^超聲心動圖對各組大鼠各項指標(biāo)進(jìn)行檢測，

22、包括LVIDd、LVIDs、LVEF、E/A比值、FS、EDT’、IVRT’、IVS和LVPW。實驗初，實驗大鼠各項指標(biāo)均無顯著差異(P＞0.05)。實驗?zāi)?，DCM組大鼠較正常對照組LVIDd、LVIDs、IVST、LVPW和IVRT’明顯增加(P＜0.05)，EF、E/A比值下降，F(xiàn)S增加，EDT’增加(P＜0.05)，證明DCM組大鼠發(fā)生了心臟結(jié)構(gòu)及功能異常。DCM+纈沙坦組與DCM組相比，LVIDs、LVIDd、IVST、LVPW

23、和IVRT’有所下降(P＜0.05)，EF、E/A比值升高，F(xiàn)S下降，EDT’降低（P＜0.05），證明纈沙坦治療能夠有效改善心臟功能，抑制心肌重構(gòu)。
　　 4.心肌組織病理學(xué)檢查
　　 H&E染色:正常對照組心肌細(xì)胞排列整齊，大小均一，胞漿染色均勻;DCM組與正常對照組相比，心肌細(xì)胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，細(xì)胞肥大減輕，排列較規(guī)則。
　　 Masson染色:正常對照組心肌膠原

24、纖維排列整齊，心肌小動脈周圍少量膠原沉積，心肌間質(zhì)內(nèi)少量膠原組織呈散在、長索條狀分布;DCM組與正常對照組相比，心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，心肌內(nèi)小血管周圍膠原沉積明顯增多，粗大膠原纖維交聯(lián)成網(wǎng)格狀;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細(xì)胞排列較整齊，心肌間質(zhì)內(nèi)和小動脈周圍膠原纖維顯著減少。
　　 天狼星紅染色:DCM組與正常對照組相比，(I)型及(III)型膠原顯著增加;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，膠原纖維含量有所下降。

25、>　　 5.DCM組心肌細(xì)胞凋亡增加并且纈沙坦能夠減少心肌細(xì)胞凋亡
　　 采用TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞，并通過Westemblot檢測凋亡標(biāo)志性因子Puma、cleavedeaspase3和eytochromec的表達(dá)，觀察心肌細(xì)胞凋亡的水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，DCM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增加(p＜0.05);DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少（P＜0.05）。
　　 6.DCM大鼠心肌組

26、織中存在ERS的激活并且纈沙坦能夠抑制ERS的激活
　　 GRP78、CHOP是ERS激活的重要標(biāo)志分子。通過組織免疫熒光法、Westernblot和實時定量RT-PCR檢測均顯示，正常對照組心肌組織中GRP78、CHOP僅有少量表達(dá)，而DCM組心肌GRP78、CHOP表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌中GRP78、CHOP的表達(dá)水平有所下降（P＜0.05）。上述實驗結(jié)果從mRNA及蛋白水平上

27、證明了ERS在DCM心肌損害中被激活，而纈沙坦可以發(fā)揮抑制ERS激活的作用。
　　 7.DCM大鼠心肌組織中存在XBP1的激活并且纈沙坦可以抑制XBPl的活化
　　 半定量RT-PCR和Westernblot檢測顯示，與正常對照組相比，DCM組XBPl-s表達(dá)顯著增加(P＜0.05);DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌組織中XBPl-s表達(dá)有所下調(diào)(P＜0.05)。上述實驗結(jié)果表明DCM心肌組織中存在XBP1的活化，而

28、纈沙坦治療可以抑制XBP1的激活。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過一次性注射STZ，成功構(gòu)建了DCM大鼠模型，為DCM發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的動物模型。
　　 2.驗證了DCM病程中心肌重構(gòu)的存在，證明了心肌細(xì)胞凋亡的增加在DCM病程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.DCM心肌組織GRP78、CHOP表達(dá)上調(diào)，證實了DCM病程中存在ERS的激活。
　　 4.DCM心肌組織中存在ERS關(guān)鍵因子XBP1的

29、活化，證明DCM病程中存在著XBP1調(diào)控的ERS相關(guān)凋亡途徑的激活。
　　 5.纈沙坦能夠抑制DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)，其作用靶點可能與抑制XBP1的激活有關(guān)。
　　 第二部分：論文ⅡXBP1在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究
　　 研究背景：
　　 糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)是糖尿病最重要的靶器官并發(fā)癥之一，以心肌細(xì)胞肥大、凋亡以及

30、間質(zhì)纖維化為主要病理特征。DCM疾病早期主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大以及少量的心肌細(xì)胞凋亡;隨著疾病的發(fā)展，凋亡逐漸增多，使得心肌細(xì)胞數(shù)目大量減少，并最終加重DCM病程中的心肌重構(gòu)與功能障礙。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)過程中的未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldingproteinresponse，UPR)與糖尿病病程中葡萄糖、脂肪代謝紊亂存在著密切的聯(lián)系。當(dāng)機(jī)體處于代謝障礙的狀態(tài)下，內(nèi)

31、質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)作為細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成加工的主要場所，負(fù)荷劇增，觸發(fā)UPR，導(dǎo)致ERS的發(fā)生。ERS可能是糖脂代謝紊亂中尤為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而葡萄糖利用障礙導(dǎo)致的心肌能量代謝紊亂是DCM心肌細(xì)胞凋亡的主要原因之一。因此，ERS可能在DCM心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了極其重要的作用。
　　 X盒結(jié)合蛋白l(X-boxbindingprotein1，XBP1)是調(diào)控ERS的關(guān)鍵分子。ERS時，XBP1

32、mRNA由ATF6誘導(dǎo)并經(jīng)IRE1特異性剪切，產(chǎn)生一種高活性轉(zhuǎn)錄因子XBP1-s，從而激活UPR。適度的ERS時，剪接后活化的XBP1能夠特異性的與未折疊蛋白反應(yīng)元件（unfoldedproteinresponseelement，UPRE）結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)因子α甘露糖苷酶樣蛋白（ERdegradationenhancingα-mannosidase-likeprotein，EDEM）基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)GRP78等分子伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄

33、活性，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ERassociateddegration，ERAD），促進(jìn)未折疊和錯誤折疊糖蛋白的降解，從而促進(jìn)了細(xì)胞的存活。然而，持續(xù)嚴(yán)重的ERS時，活化后的XBP1則與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件(ERstresselement，ERSE)相結(jié)合，激活相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號。而C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein，CHOP)作為C/EBP家族中堿性亮氨酸拉鏈蛋白(basicregionleucinezippe

34、r)的轉(zhuǎn)錄因子，它的啟動子恰好包含了至少兩種ERSE序列。因此，在DCM病程中，XBP1-s可能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。
　　 CHOP在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)廣泛，參與細(xì)胞能量代謝、增殖、凋亡等多種病理生理過程。CHOP通路是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的三條主要通路之一，也是最為重要的ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路。然而，XBP1-s和CHOP的表達(dá)均有組織特異性，并且隨刺激因素的不同其表達(dá)活性亦存在差異。在DCM心

35、肌組織中，是否存在XBP1-s和CHOP的表達(dá)上調(diào)，以及CHOP基因的轉(zhuǎn)錄激活是否與XBP1-s有關(guān)，目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究。
　　 線粒體是細(xì)胞的能量工廠，也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的最重要細(xì)胞器之一，而CHOP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。線粒體依賴的凋亡途徑受Bcl-2家族成員的調(diào)控，p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53upregulatedmodulatorofapoptosis，Puma)是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族

36、BH3-only促凋亡蛋白成員。有研究發(fā)現(xiàn)Puma極有可能是聯(lián)系ERS和線粒體凋亡的重要因子。Puma通過直接或間接地與抑制凋亡的Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL對促凋亡的Bax/Bak蛋白的抑制作用，促使Bax/Bak構(gòu)象發(fā)生改變后在線粒體膜上形成寡聚物，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)的cytochromee釋放入胞質(zhì)，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致cleavedcaspase3表達(dá)上調(diào)，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。

37、生理狀態(tài)下，Puma的表達(dá)量非常低，而當(dāng)諸如DNA損傷、ERS等多種應(yīng)激刺激發(fā)生時，各種應(yīng)激刺激通過p53依賴性和非依賴性的細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)Puma的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究表明，ERS發(fā)生時，Puma表達(dá)相應(yīng)上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示ERS與Puma之間可能存在著一定的聯(lián)系。然而，在DCM病程中，ERS相關(guān)凋亡信號是否通過線粒體凋亡途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡？CHOP和Puma是否在這個過程中發(fā)揮了極為重要的橋

38、梁作用？這一系列問題仍有待進(jìn)一步探討。
　　 基于以上討論，本課題提出以下假說:在DCM病程中，ERS通過激活XBP1，誘導(dǎo)CHOP基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步激活Puma介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。圍繞這一假說，本研究采用高糖刺激原代乳鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，探討XBP1、CHOP、Puma三種關(guān)鍵因子在ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用及其三者之間可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為闡明ERS介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋

39、亡的相關(guān)通路提供全新的理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.驗證高糖誘導(dǎo)ERS介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　 2.探討XBP1、CHOP、Puma在ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。
　　 3.明確XBP1、CHOP、Puma三者之間可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 4.證實高糖刺激下，ERS可能通過XBP1/CHOP/Puma途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 研究方法：
　　

40、 1.原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 取1～3天的Wistar新生乳鼠心臟，剪碎、胰酶消化、差速貼壁，獲取心肌細(xì)胞。生長至亞融合狀態(tài)，可觀察到心肌細(xì)胞搏動，進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.原代心肌細(xì)胞的鑒定
　　 采用肌鈣蛋白T單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色對原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
　　 3.實驗設(shè)計
　　 在體外模擬糖尿病狀態(tài)，加入不同的刺激因素，研究心肌細(xì)胞干預(yù)后的

41、變化。對細(xì)胞分別進(jìn)行以下處理:心肌細(xì)胞用一定濃度梯度的D-葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L和33.3mmol/L)處理;心肌細(xì)胞用27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/LD-葡萄糖處理作為對照;高糖（33.3mmol/LD-葡萄糖）+XBPlsiRNA孵育細(xì)胞;高糖（33.3mmol/LD-葡萄糖）+CHOPsiRNA孵育細(xì)胞。
　　 4.小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)技

42、術(shù)
　　 采用siRNA技術(shù)分別抑制XBP1和CHOP的表達(dá)，觀察二者之間及其下游因子的表達(dá)變化。將提取的原代乳鼠心肌細(xì)胞分別用XBP1和CHOP的siRNA預(yù)處理24小時，再給予高糖刺激48h，收取細(xì)胞，通過流式細(xì)胞技術(shù)和Westernblot等技術(shù)檢測其下游因子的表達(dá)及細(xì)胞凋亡水平。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡水平
　　 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測心肌細(xì)胞的凋亡情況，計算心肌細(xì)胞的凋亡率。
　　

43、6.Westernblot檢測
　　 收集細(xì)胞，提取總蛋白和細(xì)胞核蛋白，分別經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、顯色等步驟，檢測GRP78，XBP1-s，CHOP，Puma，cleavedcaspase3和cytochromec的表達(dá)。
　　 7.半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測
　　 收集細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得eDNA，以β-actin作為參照，通過

44、半定量RT-PCR技術(shù)檢測XBP1-s的mRNA表達(dá)，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測GRP78，CHOP和Puma的mRNA表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：
　　 2.1.D-葡萄糖刺激心肌細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)濃度梯度依賴性
　　 分別以低糖（含5.5mmol/LD-葡萄糖）、中糖（含16.7mmol/LD-葡萄糖）、高糖（含33.3mmol/LD-葡萄糖）和甘露醇（含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖）刺

45、激心肌細(xì)胞48h，流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示中糖及高糖刺激組較低糖刺激組凋亡率明顯增加(P＜0.05);而甘露醇對照組的細(xì)胞凋亡率與低糖組相比未見明顯變化(P＞0.05)。由此可見，高濃度D-葡萄糖刺激可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而刺激心肌細(xì)胞凋亡的最佳D-葡萄糖濃度為33.3mmol/L，刺激時間為48h。
　　 2.2.高糖刺激心肌細(xì)胞觸發(fā)ERS
　　 分別以低糖（含5.5mmol/LD-葡萄糖）、高糖（含33

46、.3mmol/LD-葡萄糖）和甘露醇（含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖）刺激心肌細(xì)胞48h，收取三組細(xì)胞采用實時定量RT-PCR和Westemblot的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:高糖刺激組與低糖對照組相比，ERS的標(biāo)志性因子GRP78mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖對照組相比，GRP78mRNA和蛋白表達(dá)水平未見明顯變化(P＞0.05)，說明高糖刺激心肌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ERS的發(fā)生

47、。
　　 2.3.高糖刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡過程中XBP1-s、CHOP和Puma的表達(dá)上調(diào)
　　 對低糖、高糖、甘露醇對照組細(xì)胞中XBP1-s、CHOP和Puma的表達(dá)進(jìn)行半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和Westernblot檢測，結(jié)果顯示:高糖組與低糖對照組相比，XBP1活化因子XBP1-s、CHOP和Puma的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖組相比，XBP1-s、CHOP和

48、Puma的mRNA和蛋白表達(dá)水平均未見明顯變化（P＞0.05）。
　　 同時，對各組中的凋亡因子cleavedcaspase3、cytochromec進(jìn)行Westernblot檢測，結(jié)果顯示高糖組與低糖對照組相比，cleavedcaspase3、cytochromec表達(dá)顯著增加(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖組相比，cleavedcaspase3、cytochromec表達(dá)未見顯著變化（P＞0.05）。
　　 由

49、此可見高糖刺激能夠促使ERS關(guān)鍵因子XBP1，CHOP和Puma的表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡增加。上述實驗結(jié)果提示XBP1-s，CHOP和Puma在高糖刺激觸發(fā)ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡這一過程中發(fā)揮著重要的作用。2.4XBP1siRNA及CHOPsiRNA可以抑制高糖刺激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡
　　 (1)將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞應(yīng)用XBP1siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24小時后，收取細(xì)胞并用半定量RT-PCR和Westernblot法驗證siR

50、NA的轉(zhuǎn)染效力，結(jié)果顯示:siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比，XBP1的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。上述結(jié)果提示XBP1siRNA能夠有效抑制XBP1的表達(dá)。
　　 (2)將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞應(yīng)用CHOPsiRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24小時后，收取細(xì)胞并用實時定量RT-PCR及Westernblot法驗證siRNA的轉(zhuǎn)染效力，結(jié)果顯示:siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比，CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)

51、。提示CHOPsiRNA能夠有效抑制CHOP的表達(dá)。
　　 (3)采用流式細(xì)胞技術(shù)對低糖組、高糖組、XBP1siRNA組和CHOPsiRNA組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示XBP1siRNA組與高糖組相比，心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05);CHOPsiRNA組與高糖組相比，心肌細(xì)胞凋亡率亦顯著降低（P＜0.05），證實XBP1siRNA及CHOPsiRNA可以抑制高糖刺激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，說明XBP1及CHOP在高糖誘導(dǎo)

52、的心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 2.5.高糖通過XBP1/CHOP/Puma通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡
　　 本實驗中，我們采用siRNA技術(shù)抑制分別XBP1和CHOP的表達(dá)，觀察兩者分別抑制后XBP1-s、CHOP和Puma的表達(dá)情況。
　　 分別對低糖組、高糖組、XBPlsiRNA組（先應(yīng)用XBP1siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24小時后，再予以高糖刺激48小時）和CHOPsiRNA組（先應(yīng)用CHOPsiRN

53、A轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24小時后，再予以高糖刺激48小時）進(jìn)行半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和Westernblot檢測。
　　 Westernblot的結(jié)果顯示:在應(yīng)用了XBP1siRNA之后，XBP1-s蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05);與此同時，CHOP和Puma的表達(dá)也伴隨著XBPl-s的表達(dá)減少而顯著下調(diào)(P＜0.05)，提示CHOP和Puma二者的表達(dá)受XBP1激活的調(diào)控，二者可能是XBP1的下游因子。在使用了CH

54、OPsiRNA之后，XBP1-s的表達(dá)未受到顯著影響(P＞0.05);與此同時，伴隨著CHOP表達(dá)的下調(diào)，Puma的表達(dá)也隨之下降(P＜0.05)，說明抑制CHOP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活對XBP1的表達(dá)無顯著影響，但對Puma的表達(dá)有顯著下調(diào)作用，這進(jìn)一步提示CHOP是XBP1的下游因子，而Puma則更可能位于CHOP的下游。同時，通過半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR檢測上述因子的mRNA表達(dá)水平，所得到的結(jié)論與上述蛋白檢測結(jié)果相吻合。

55、綜上所述，我們得出了XBP1、CHOP和Puma三者之間存在著上下游關(guān)系，XBP1/CHOP/Puma通路在高糖刺激觸發(fā)ERS所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.驗證了高糖刺激可以通過激活ERS進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 2.首次證明XBP1在高糖刺激下ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.首次證明了高糖刺激下，XBP1/CHOP/Puma信號轉(zhuǎn)