雷公藤甲素對HCN4基因修飾大鼠MSCs同種異體心臟移植后細(xì)胞存活影響的研究.pdf

1、背景與目的：電子心臟起搏器是目前臨床上治療緩慢性心律失常（病態(tài)竇房結(jié)綜合征及完全性房室傳導(dǎo)阻滯等）的有效方法。雖然電子心臟起搏器治療已挽救了數(shù)百萬患者的生命，但因電子心臟起搏器植入術(shù)存在諸多問題（如缺乏對機體神經(jīng)遞質(zhì)變化的自動反應(yīng)性、電極位置不穩(wěn)定、電池壽命有限、嚴(yán)重感染及電磁干擾等）而并非最佳選擇。鑒于上述原因，基于細(xì)胞和基因治療的“生物起搏器”已成為當(dāng)前緩慢性心律失常治療領(lǐng)域研究的熱點之一。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenc

2、hymalstemcells，MSCs)作為具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，目前已成為最具前景的“種子細(xì)胞”。其不僅能夠容易從骨髓中獲取，且通過注射方式移植至心肌后能夠分化成心肌樣細(xì)胞。本課題組近期的實驗研究顯示攜帶HCN4基因的MSCs(HCN4-MSCs)同種異體移植到犬完全性房室傳導(dǎo)阻滯模型心臟后能產(chǎn)生源自注射部位的自發(fā)頻率，但因其頻率明顯低于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的心臟起搏樣細(xì)胞的自發(fā)頻率，推測移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)大量死亡可能是其頻率低下的原

3、因之一。
　　在體動物實驗研究已證實大多數(shù)移植至心臟的MSCs均在移植后的最初兩天內(nèi)死亡，急性炎癥反應(yīng)可能是移植細(xì)胞死亡的重要原因。另有研究顯示MSCs體內(nèi)移植后存活率為20-30％，移植細(xì)胞死亡的主要原因可能為缺血、凋亡、炎癥或免疫排斥反應(yīng)。由此可見，MSCs移植治療效果因移植細(xì)胞低生存率而受到影響，而尋找防治移植細(xì)胞死亡、提高移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)存活率新方法，則有助于提高細(xì)胞移植效果。
　　雷公藤甲素是從中藥雷公藤中提取出

4、的小分子活性物質(zhì)，目前研究顯示雷公藤甲素具有抗炎和免疫抑制作用，將其用于MSCs移植治療，可能有助于抑制急性炎癥反應(yīng)和免疫排斥，減少移植細(xì)胞死亡、提高移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的存活率。
　　因此，本研究擬在行HCN4-MSCs同種異體心臟移植時，用雷公藤甲素進(jìn)行干預(yù)，以探討雷公藤甲素對移植細(xì)胞存活率的影響及可能機制。
　　方法：
　　1.無菌條件下取健康雄性SD大鼠雙側(cè)股骨及脛骨的骨髓，經(jīng)密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得MS

5、Cs，然后通過頻繁的換液體外進(jìn)行擴增及純化。
　　2.以mHCN4慢病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，轉(zhuǎn)染后應(yīng)用殺稻瘟菌素藥物加壓篩選。免疫熒光法檢測mHCN4及EGFP目的基因的表達(dá)情況。CCK-8法檢測HCN4-MSCs的細(xì)胞增值能力。
　　3.應(yīng)用性別錯配的細(xì)胞移植模型，即將雄性來源的HCN4-MSCs同種異體移植到雌性SD大鼠心臟，通過定量RT-PCR法檢測雌性大鼠心臟中雄性基因Sry的表

6、達(dá)量而得出移植細(xì)胞的存活數(shù)量。首先將已知數(shù)量且經(jīng)過倍比稀釋的(2.0×102，2.0×103，2.0×104，2.0×105，2.0×106)HCN4-MSCs體外注射入雌性大鼠心臟中通過檢測雄性基因Sry的表達(dá)量得出移植細(xì)胞數(shù)量與Sry的表達(dá)量之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　4.將不同數(shù)量的HCN4-MSCs通過開胸心外膜直視下注射法以單點心肌注射方式同種異體移植到雌性SD大鼠心臟，用定量RT-PCR法檢測心臟標(biāo)本中Sry的表達(dá)量，根

7、據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出移植細(xì)胞的最佳移植數(shù)量。
　　5.將按照最佳移植數(shù)量進(jìn)行細(xì)胞移植術(shù)的雌性SD大鼠隨機分為三組（每組30只大鼠）:
　　(1)雷公藤甲素組(Tri):大鼠腹腔內(nèi)注射雷公藤甲素200μg/kg/d，共10天（術(shù)前3天至術(shù)后7天）;
　　(2)地塞米松組(Dex):大鼠腹腔內(nèi)注射地塞米松400μg/kg/d，共10天（術(shù)前3天至術(shù)后7天）;
　　(3)對照組(Con):大鼠腹腔內(nèi)注射無菌生理鹽水（2ml/

8、次），共10天（術(shù)前3天至術(shù)后7天）。
　　6.各組動物按術(shù)后觀察時間點不同（術(shù)后24小時、72小時、7天、14天、28天）分為5各亞組（每個亞組6只大鼠）。于細(xì)胞移植后不同時間點采集血標(biāo)本或處死動物、取出心臟，進(jìn)行標(biāo)本處理及以下檢測。
　　(1)對各時間點心臟標(biāo)本用定量RT-PCR法檢測雌性大鼠心臟標(biāo)本中雄性基因Sry的表達(dá)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出移植細(xì)胞的存活數(shù)量。
　　(2)于術(shù)后24小時、72小時取血，以ELISA

9、法檢測血清中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α的蛋白表達(dá)水平。同時用RT-PCR法測定包含細(xì)胞移植區(qū)心肌組織上述相關(guān)因子mRNA的表達(dá)。
　　(3)TUNEL法檢測細(xì)胞移植區(qū)移植細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況，免疫印跡法檢測細(xì)胞移植區(qū)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)，膜片鉗檢測細(xì)胞移植區(qū)域移植細(xì)胞的起搏電流(If)。
　　(4)細(xì)胞移植術(shù)后28天，麻醉后處死大鼠，細(xì)胞移植區(qū)心肌組織應(yīng)用4％多聚甲醛

10、固定、石蠟包埋后切片，利用免疫組化的方法檢測心肌特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)及縫隙連接蛋白43(connexin43，CX43)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)出的第二代MSCs緊貼于培養(yǎng)瓶壁上，外觀呈紡錘形或多角形。流式檢測結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗原CD29和CD90呈陽性表達(dá)，抗原CD45呈陰性表達(dá)。
　　2.成功地將攜帶mHCN4基因的慢病毒載體(pMSCV-mHC

11、N4-EGFP)轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓MSCs。在MOI=10的條件下，轉(zhuǎn)染效率約為67％，抗生素篩選后陽性率可達(dá)90％以上。免疫熒光染色證實轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)mHCN4及EGFP蛋白。CCK-8法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mHCN4后的骨髓MSCs呈現(xiàn)較強的增值能力。
　　3.體外將雄性來源且倍比稀釋(2.0×102，2.0×103，2.0×104，2.0×105及2.0×106)的HCN4-MSCs分別移植入雌性大鼠心肌中，定量RT-PCR技

12、術(shù)檢測標(biāo)本中Sry的表達(dá)量，得出移植細(xì)胞數(shù)量與Sry基因表達(dá)量的間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　4.應(yīng)用性別錯配的移植模型將不同數(shù)量的HCN4-MSCs同種異體移植到雌性大鼠心臟中，移植后72小時定量RT-PCR法檢測心臟標(biāo)本中Sry的表達(dá)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出移植細(xì)胞的存活數(shù)量。結(jié)果顯示1×106為細(xì)胞同種異體心臟移植單點心肌注射的最佳移植數(shù)量。
　　5.選取1×106為移植細(xì)胞數(shù)量，雷公藤甲素治療組HCN4-MSCs心肌內(nèi)移植后2

13、4小時、72小時、7天、14天及28天，移植細(xì)胞的存活率分別為29.27±0.93％、17.55±1.24％、7.37±0.34％、4.15±0.38％及3.40±0.14％;均顯著高于相同時間段對照組的細(xì)胞存活率14.74±0.94％、6.90±0.19％、3.17±0.16％、1.41±0.40％和0.76±0.36％（各時間段P＜0.01）。地塞米松干預(yù)組在相同時間段細(xì)胞的存活率分別為28.17±1.76％、15.63±0.36％

14、、6.08±0.26％、3.38±0.32％和2.55±0.12％;也顯著高于對照組的細(xì)胞存活率（n=4/組/時間點，各時間段P＜0.01）。
　　6.直接心肌注射可引起機械性損傷隨后產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，引起移植細(xì)胞的死亡。雷公藤甲素具有抗炎作用，能夠降低核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和IL-1β，IL-6及TNF-α三種炎癥因子的表達(dá)水平。短期應(yīng)用雷公藤甲素干預(yù)治療能夠提高HCN4-MSCs心肌內(nèi)移植后的存活率。
　　7.雷公藤甲素干

15、預(yù)治療可減少移植細(xì)胞的凋亡發(fā)生率，降低移植區(qū)域促凋亡蛋白Bax的表達(dá)但升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。
　　8.膜片鉗檢測結(jié)果示HCN4-MSCs心肌內(nèi)移植后在宿主心臟中存活4周以上并可記錄到被CsCl可逆性阻斷的超極化激活的起搏電流(If)。雷公藤甲素干預(yù)治療對移植細(xì)胞的功能無不良影響。
　　9.免疫組化檢測結(jié)果顯示部分HCN4-MSCs心肌內(nèi)移植后4周既表達(dá)EGFP又表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT或縫隙連接蛋白CX43

16、，提示HCN4-MSCs心肌內(nèi)移植后分化為新的心肌樣細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.不同數(shù)量雄性來源的HCN4-MSCs應(yīng)用性別錯配的移植模型同種異體移植到雌性大鼠心臟中，定量RT-PCR檢測Sry基因表達(dá)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各組移植細(xì)胞的存活數(shù)量，結(jié)果示1×106為細(xì)胞同種異體心臟移植單點心肌注射的最佳細(xì)胞移植數(shù)量。
　　2.雷公藤甲素干預(yù)治療可提高HCN4-MSCs心臟移植后的存活率。其機制可能為直接心肌注射引起機械性