睪酮對亞急性衰老小鼠下丘腦的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、人口老齡化是二十一世紀(jì)人類發(fā)展的主要特征，在我國尤其明顯。根據(jù)新公布的國家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報(bào)告表明，二十世紀(jì)末，我國60歲以上老年人口占總?cè)丝诘谋壤^10%；2005年底，我國60歲以上老年人口近1.44億，占總?cè)丝诘谋壤_(dá)11%；當(dāng)前，我國老年人口正以年均約3%的速度增長，并將以每10年純增1億老年人口的速度加速老齡化進(jìn)程。隨著老年人口的增多，我國老年人疾病譜也由相對分散向相對集中轉(zhuǎn)變，發(fā)病率前五位是高血壓、冠心病、腦血管病、糖尿病

2、、腫瘤。其中以腦老化為表現(xiàn)的疾病在老年人群中的高發(fā)病率使其成為威脅老年人健康的重要疾病。因此急需開展腦老化發(fā)病機(jī)制及防治對策的研究。 腦老化發(fā)生的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素包括年齡、高血壓、高血脂、吸煙、高血糖、以及性別等，以往一直認(rèn)為年齡屬于腦老化不可改變的危險(xiǎn)因素，因此研究相對較少。隨著人口老齡化的日益發(fā)展，有關(guān)年齡在腦老化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究逐漸引起重視，并成為防治腦老化的新靶點(diǎn)。流行病學(xué)研究表明年齡是腦老化發(fā)生與發(fā)展的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，隨

3、著年齡的增加，促使腦老化的發(fā)生率顯著升高的一個(gè)最具有老年人特點(diǎn)的原因是腦組織隨增齡發(fā)生了變化，部分腦細(xì)胞發(fā)生了衰老，表現(xiàn)為腦重量的下降、腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少及腦細(xì)胞中出現(xiàn)老年色素等。現(xiàn)在越來越多的研究表明腦老化狀態(tài)下的腦細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，腦細(xì)胞的衰老是腦老化的重要原因這一觀點(diǎn)已被廣泛認(rèn)同。研究發(fā)現(xiàn)，作為高級神經(jīng)內(nèi)分泌中樞的下丘腦是腦老化過程中較先出現(xiàn)老化的部位，提示下丘腦可能在衰老發(fā)展中起重要作用?，F(xiàn)在不少老年醫(yī)學(xué)的專家建議將抗衰老治療當(dāng)

4、作治療腦老化的一項(xiàng)新的治療策略。那么隨著增齡腦組織為什么會發(fā)生這些變化，腦細(xì)胞為什么會衰老，隱藏在腦老化后的細(xì)胞和分子水平的衰老機(jī)制是什么？這種機(jī)制是否可為改善或者延緩腦老化提供重要思路？在人口老齡化日益發(fā)展的現(xiàn)狀下，這已成為腦老化防治急需回答的關(guān)鍵問題之一。 在增齡過程中，另一個(gè)顯著變化是性激素平衡的改變。睪酮是男性體內(nèi)最重要的雄激素，屬于一種合成激素，研究發(fā)現(xiàn)，男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現(xiàn)明顯下降。老年男

5、性血漿睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。多項(xiàng)睪酮替代治療的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，睪酮可改善老年人認(rèn)知能力、調(diào)整肌肉脂肪比例，加強(qiáng)肌肉力量，增強(qiáng)運(yùn)動能力，抑制血脂異常。減少胰島素抵抗，改善性功能等等，但睪酮能否改善老年男性的下丘腦功能，延緩老年性腦老化的發(fā)生，文獻(xiàn)未見報(bào)道。我們之前的研究表明，睪酮在體外干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，但對下丘腦函待研究。 生物衰老的各種變化，不僅表現(xiàn)在宏觀上，更主要的是表現(xiàn)在微

6、觀上。衰老機(jī)制的研究，現(xiàn)在已經(jīng)從整體水平、器官水平發(fā)展到細(xì)胞水平、分子水平。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，目前國內(nèi)外對衰老機(jī)制開展的多方面研究都有很大的進(jìn)展，并提出若干具有較高水平的衰老學(xué)說，有自由基學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說、生物膜損害學(xué)說、遺傳程序?qū)W說、染色體突變學(xué)說、差錯(cuò)學(xué)說、免疫學(xué)說、內(nèi)分泌學(xué)說等。總體來講上述這些學(xué)說可分為兩大類：即一類為以ROS、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論，認(rèn)為衰老

7、是環(huán)境因素對細(xì)胞進(jìn)行性和累積性毀壞的結(jié)果，另一類是以端?？s短、細(xì)胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論，認(rèn)為衰老是機(jī)體有序的基因活動，是通過遺傳按程序預(yù)先安排好的，或?yàn)樘禺惖摹八ダ稀被蛩磉_(dá)，或?yàn)榭捎没虻淖罱K耗竭。這些學(xué)說從不同學(xué)科角度出發(fā)，對衰老機(jī)制進(jìn)行了較為深入的探索，目前正逐漸向更深層次的研究方向發(fā)展，并已經(jīng)逐漸走進(jìn)了將上述兩大理論進(jìn)行合作的時(shí)代，即將研究集中在環(huán)境因子傷害造成衰老的遺傳程序改變的相關(guān)范圍之內(nèi)。

8、 D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠模型是目前常采用的衰老模型，在一定時(shí)間內(nèi)通過皮下連續(xù)注射D-半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，該物質(zhì)不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步代謝而堆積，影響細(xì)胞正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，ROS堆積。D-半乳糖在體內(nèi)可形成晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE），AGE可加強(qiáng)ROS損傷并引起微管相關(guān)蛋白（Tau）異常磷酸化及細(xì)胞骨架微絲集結(jié)，參與了D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老過程，非酶性糖化作用也是促進(jìn)ROS

9、致腦衰老的途徑之一。腦內(nèi)ROS的堆積是否參與了腦老化的形成，其作用機(jī)制如何？目前尚不明確。 研究目的： 本研究用睪酮干預(yù)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠模型，通過對下丘腦組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察和SA-β-半乳糖苷酶活性的測定，探討連續(xù)5個(gè)月皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d的小鼠下丘腦是否發(fā)生衰老及睪酮對下丘腦衰老是否具有干預(yù)作用；并且通過測定細(xì)胞周期調(diào)控因子p16INK4a的表達(dá)變化來探討下丘腦衰老的機(jī)制以及睪酮干預(yù)的可能

10、途徑。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)小鼠分組及模型的建立 將SPF級8-12周齡24只C57雄性健康小鼠隨機(jī)分為3組，每組各8只： （1）D-半乳糖組：背部皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d，用藥5個(gè)月； （2）睪酮干預(yù)組：在D-半乳糖組基礎(chǔ)上，背部皮下注射十一酸睪酮5mg/kg.2w，用藥5個(gè)月； （3）正常對照組：背部皮下注射相等劑量生理鹽水，1次/d，用藥5個(gè)月。 2、模型建立后

11、，觀察各組小鼠一般情況（觸須、體型等方面）及體重。 3、小鼠腦組織的分離和下丘腦組織切片的制作。 4、用HE染色法觀察各組小鼠下丘腦組織切片的染色情況。 5、用SA-β-半乳糖苷酶染色法測定各組小鼠下丘腦染色陽性細(xì)胞百分比。 6、用免疫組化法測定各組小鼠下丘腦p16INK4a蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率。 統(tǒng)計(jì)分析： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析。所得數(shù)據(jù)均以x±s表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因

12、素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.各組小鼠一般情況及體重： 模型建立后，D-半乳糖組小鼠普遍出現(xiàn)觸須脫落、弓背、豎毛、行動遲緩等體征，而正常對照組小鼠觸須完整，行動敏捷，無弓背、豎毛現(xiàn)象。睪酮干預(yù)組小鼠亦未出現(xiàn)觸須脫落、弓背、豎毛、行動遲緩等體征。與正常對照組比較，D-半乳糖組小鼠體重明顯降低，差異有顯著性（P<0.05）；與D-半乳糖組比較，睪酮干預(yù)組

13、小鼠體重明顯升高，差異有顯著性（P<0.05），但仍低于正常對照組（P<0.05）。 2.各組小鼠下丘腦HE染色情況 在400倍鏡下觀察，正常對照組可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞排列規(guī)整，核深染，核膜清晰，核仁明顯；D-半乳糖組可見組織結(jié)構(gòu)疏松，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，神經(jīng)元細(xì)胞周圍間隙增寬；睪酮干預(yù)組可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較D-半乳糖組增多，核深染，核膜清晰，核仁明顯。 3.各組

14、小鼠下丘腦SA-β-半乳糖甘酶染色陽性細(xì)胞百分比 SA-β-半乳糖甘酶染色顯示衰老細(xì)胞胞漿和胞核藍(lán)染，定為陽性細(xì)胞。計(jì)算各組染色陽性細(xì)胞百分比后發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖組染色陽性細(xì)胞百分比較正常對照組明顯升高（P<0.05），符合衰老細(xì)胞特征。睪酮干預(yù)使染色陽性細(xì)胞百分比較衰老組明顯降低（P<0.05），但仍高于正常對照組（P<0.05）。 4.各組小鼠下丘腦p16INK4a蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率 與正常對照組比較，D-半乳

15、糖組小鼠下丘腦p16INK4a蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯升高，差異有顯著性（P<0.05）；與D-半乳糖組比較，睪酮干預(yù)組小鼠下丘腦p16INK4a蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯降低，差異有顯著性（P<0.05），但仍高于正常對照組（P<0.05）。 結(jié)論： 1.亞急性衰老小鼠下丘腦HE染色可見部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶染色陽性細(xì)胞百分比升高，p16INK4a表達(dá)增多，說明D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠下丘腦發(fā)生了