乙型肝炎患者HBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)表位變異的測(cè)序分析.pdf

1、乙型肝炎是危害人民健康的重要疾病。雖然在其發(fā)病機(jī)制取得了多方面的進(jìn)展，但仍有許多重要問題需要闡明。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）本身通常并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損害，而大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟提示細(xì)胞免疫與乙型肝炎肝細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。HBV抗原表位特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）應(yīng)答是機(jī)體清除或控制肝細(xì)胞內(nèi)HBV感染的主要機(jī)制。病毒蛋白中的CTL表位（epitope）

2、是特異性CTL識(shí)別和攻擊的目標(biāo)。由于CTL表位的遞呈受到宿主HLA—I類分子的限制，同時(shí)HBV基因型對(duì)CTL的變異影響明顯，因而研究患者的CTL表位變異時(shí)需要確定患者的HLA—I分型和感染的HBV基因型。本研究應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，通過對(duì)HBV基因組全序列的測(cè)定，分析了急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和慢性重型乙型肝炎（chronic seve

3、re hepatitis B，CSHB）患者的HBV特異性HLA—A2限制性CTL表位變異情況，同時(shí)根據(jù)序列確定HBV基因型并分析了其對(duì)CTL表位變異的影響，旨在找到可能與乙型肝炎病程發(fā)生發(fā)展相關(guān)的表位變異。結(jié)果總結(jié)如下： 1.運(yùn)用“重疊兩段法”巢式PCR擴(kuò)增HBV基因組全序列。獲得516例乙型肝炎患者HBV全序列，其中AHB患者131例（已提交GenBank）；CHB患者239例（GenBank號(hào)：FJ386574—FJ386

4、689，F(xiàn)J562218—FJ562340）；CSHB146例（GenBank號(hào)：EU939536—EU939681）。 2.運(yùn)用MEGA4.0軟件分析HBV全序列構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行HBV基因分型。其中急性乙型肝炎患者中，B基因型27例占20.6％；C基因型103例占78.6％；D基因型1例占0.8％；慢性乙型肝炎患者中，B基因型51例占21.3％；C基因型184例占77.0％；D型4例占1.7％；慢性重型乙型肝炎中，B基因型33例

5、占22.6％；C基因型111例占76.0％；D基因型2例占1.4％。三組患者的病毒基因型構(gòu)成比無顯著差異。 3.通過血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對(duì)516例乙型肝炎患者進(jìn)行HLA—A2基因分型。結(jié)果AHB患者中HLA—A2陽(yáng)性67例，占51.1％； CHB患者中HLA—A2陽(yáng)性109例，占45.6％；CSHB炎患者中HLA—A2陽(yáng)性71例，占48.6％。三者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異，與文獻(xiàn)報(bào)道的健康人群陽(yáng)性比例也沒有明顯差異。 4.根據(jù)

6、文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)鑒定過的HBV特異性HLA—A2限制性CTL表位來分析獲得的HLA—A2陽(yáng)性患者的表位變異結(jié)果。所有HBV基因型患者一起進(jìn)行比較時(shí)，X92-100和S177-185表位變異發(fā)生率在AHB、CHB和CSHB三組患者有極顯著差異（P均<0.01）。僅HBV B基因型患者進(jìn)行比較時(shí)，P455—463和P816—824表位變異發(fā)生率在三組患者間有極顯著差異（P均<0.01）。僅HBV C基因型患者進(jìn)行比較時(shí)，三組患者間有6個(gè)表位變異

7、發(fā)生率有顯著或非常顯著差異，包括X92-100（P<0.01）、X102-110（P<0.05）、X115-123（P<0.05）、S131-139（P<0.05）、S177-185（P<0.01）和S183-191（P<0.05）。此外，S335—343（P=0.05）和S269—278（P=0.11）表位變異發(fā)生率也有明顯差別，雖然P值未達(dá)到顯著差異，但經(jīng)SAS軟件趨勢(shì)檢驗(yàn)，三組患者在該表位有相關(guān)趨勢(shì)，增大樣本量可達(dá)到顯著差異。多數(shù)

8、變異表位中只有一個(gè)氨基酸發(fā)生了替換，少數(shù)表位可有多個(gè)氨基酸發(fā)生改變，例如X36—44、S201—210和S204—212表位。由于一些表位相互重疊，包括S177-185和S183-191、S201—210和S204—212、S269—278和S271—280、S335—343和S338—347表位間，從而一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變化可以引起兩個(gè)CTL表位同時(shí)變異。表位C18—27（FLPSDFFPSV）247例患者中有227例（占91.9％）突