乙型肝炎患者HBV特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)表位變異的測序分析.pdf

1、乙型肝炎是危害人民健康的重要疾病。雖然在其發(fā)病機制取得了多方面的進展，但仍有許多重要問題需要闡明。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）本身通常并不直接導致肝細胞損害，而大量淋巴細胞浸潤肝臟提示細胞免疫與乙型肝炎肝細胞的損傷密切相關(guān)。HBV抗原表位特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）應(yīng)答是機體清除或控制肝細胞內(nèi)HBV感染的主要機制。病毒蛋白中的CTL表位（epitope）

2、是特異性CTL識別和攻擊的目標。由于CTL表位的遞呈受到宿主HLA—I類分子的限制，同時HBV基因型對CTL的變異影響明顯，因而研究患者的CTL表位變異時需要確定患者的HLA—I分型和感染的HBV基因型。本研究應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法，通過對HBV基因組全序列的測定，分析了急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和慢性重型乙型肝炎（chronic seve

3、re hepatitis B，CSHB）患者的HBV特異性HLA—A2限制性CTL表位變異情況，同時根據(jù)序列確定HBV基因型并分析了其對CTL表位變異的影響，旨在找到可能與乙型肝炎病程發(fā)生發(fā)展相關(guān)的表位變異。結(jié)果總結(jié)如下： 1.運用“重疊兩段法”巢式PCR擴增HBV基因組全序列。獲得516例乙型肝炎患者HBV全序列，其中AHB患者131例（已提交GenBank）；CHB患者239例（GenBank號：FJ386574—FJ386

4、689，F(xiàn)J562218—FJ562340）；CSHB146例（GenBank號：EU939536—EU939681）。 2.運用MEGA4.0軟件分析HBV全序列構(gòu)建進化樹進行HBV基因分型。其中急性乙型肝炎患者中，B基因型27例占20.6％；C基因型103例占78.6％；D基因型1例占0.8％；慢性乙型肝炎患者中，B基因型51例占21.3％；C基因型184例占77.0％；D型4例占1.7％；慢性重型乙型肝炎中，B基因型33例

5、占22.6％；C基因型111例占76.0％；D基因型2例占1.4％。三組患者的病毒基因型構(gòu)成比無顯著差異。 3.通過血清學和細胞學方法對516例乙型肝炎患者進行HLA—A2基因分型。結(jié)果AHB患者中HLA—A2陽性67例，占51.1％； CHB患者中HLA—A2陽性109例，占45.6％；CSHB炎患者中HLA—A2陽性71例，占48.6％。三者之間統(tǒng)計學上沒有差異，與文獻報道的健康人群陽性比例也沒有明顯差異。 4.根據(jù)

6、文獻報道已經(jīng)鑒定過的HBV特異性HLA—A2限制性CTL表位來分析獲得的HLA—A2陽性患者的表位變異結(jié)果。所有HBV基因型患者一起進行比較時，X92-100和S177-185表位變異發(fā)生率在AHB、CHB和CSHB三組患者有極顯著差異（P均<0.01）。僅HBV B基因型患者進行比較時，P455—463和P816—824表位變異發(fā)生率在三組患者間有極顯著差異（P均<0.01）。僅HBV C基因型患者進行比較時，三組患者間有6個表位變異

7、發(fā)生率有顯著或非常顯著差異，包括X92-100（P<0.01）、X102-110（P<0.05）、X115-123（P<0.05）、S131-139（P<0.05）、S177-185（P<0.01）和S183-191（P<0.05）。此外，S335—343（P=0.05）和S269—278（P=0.11）表位變異發(fā)生率也有明顯差別，雖然P值未達到顯著差異，但經(jīng)SAS軟件趨勢檢驗，三組患者在該表位有相關(guān)趨勢，增大樣本量可達到顯著差異。多數(shù)

8、變異表位中只有一個氨基酸發(fā)生了替換，少數(shù)表位可有多個氨基酸發(fā)生改變，例如X36—44、S201—210和S204—212表位。由于一些表位相互重疊，包括S177-185和S183-191、S201—210和S204—212、S269—278和S271—280、S335—343和S338—347表位間，從而一個位點的氨基酸變化可以引起兩個CTL表位同時變異。表位C18—27（FLPSDFFPSV）247例患者中有227例（占91.9％）突