阿托伐他汀在ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、心、腦血管疾病是目前人類(lèi)死亡的主要原因之一，動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等重要血管疾病的病理基礎(chǔ)。隨著其發(fā)病率及死亡率不斷上升，動(dòng)脈粥樣硬化正成為心血管疾病中的熱點(diǎn)問(wèn)題而引起人們的廣泛關(guān)注。對(duì)于本病的發(fā)病機(jī)制，最早提出的是脂肪浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)，其后又提出血小板聚集和血栓形成學(xué)說(shuō)，后來(lái)又提出了動(dòng)脈粥樣硬化的損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為本病的各種危險(xiǎn)因素最終都會(huì)損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是動(dòng)脈內(nèi)膜對(duì)損傷作出反應(yīng)的結(jié)果。隨著研究的不斷深入，ROSS

2、教授在該學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)上，又提出“動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”的炎癥學(xué)說(shuō)。
　　ROSS認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈壁的一種炎癥性疾病，它的形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與炎癥介質(zhì)相互作用的結(jié)果，以粥樣斑塊內(nèi)出現(xiàn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞為特征。炎癥反應(yīng)貫穿于整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，乃至可以進(jìn)一步引起心血管事件的發(fā)生。在動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段，許多因素可以引起動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)，其中ox-LDL是一個(gè)重要的促炎

3、物質(zhì)，它可以引起許多炎性相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因表達(dá)的產(chǎn)物如粘附分子、趨化因子等可以促使局部單核細(xì)胞聚集、活化，并通過(guò)相應(yīng)的配體與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，遷移到內(nèi)皮下，激活并分泌一些細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　他汀類(lèi)(Statins)藥物屬于3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，可以降低血液膽固醇的水平，是治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中最有效的一類(lèi)。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，他汀類(lèi)藥物能夠降低心

4、腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率不僅僅依靠其降脂作用，除此之外還有多種其它的藥理作用，例如改善血管內(nèi)皮、促進(jìn)纖溶、抗血栓形成等。近年來(lái)，關(guān)于他汀類(lèi)藥物抗炎作用的研究也日漸增多，其抗炎作用的發(fā)現(xiàn)表明，應(yīng)用他汀類(lèi)藥物治療動(dòng)脈粥樣硬化除依靠其降脂作用外還有其他的益處，但是目前它具體的抗炎機(jī)制尚不明確。在本研究中，我們用ox-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和單核細(xì)胞(THP1)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，觀(guān)察阿托伐他汀能否降低ox

5、-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及闡明其影響炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　　第一章阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:觀(guān)察ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的效應(yīng)，同時(shí)用阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察阿托伐他汀能否降低ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥分子的表達(dá)。
　　方法:
　　1.HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng):復(fù)蘇HUVEC細(xì)胞，使用ECM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)及增殖活性。<

6、br>　　2.MTT法檢測(cè)ox-LDL對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖活性的影響。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組，培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對(duì)照;(2)ox-LDL刺激組(濃度為100μg/ml)，只添加ox-LDL;(3)阿托伐他汀組（1州），只添加阿托伐他汀(4)阿托伐他汀(1μM)+ox-LDL(100μg/ml)組。
　　4.Western-Blot檢測(cè)ICAM1和VCAM1蛋白的表達(dá)變化。
　　5.Real-TimePCR檢測(cè)

7、ICAM1、VCAM1和MCP-1的mRNA表達(dá)變化。
　　6.ELISA檢測(cè)HUVEC細(xì)胞分泌的MCP-1的變化
　　結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果表明0.5、1、2.5、5μM的ox-LDL均未對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生明顯影響。
　　2.Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ox-LDL可以增強(qiáng)ICAM1和VCAM1蛋白的表達(dá)，阿托伐他汀可以降低ox-LDL誘導(dǎo)的ICAM1和VCAM1蛋白的表達(dá)。

8、
　　3.Real-TimePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以升高ICAM1、VCAM1和MCP-1mRNA的表達(dá)，阿托伐他汀可以降低ox-LDL誘導(dǎo)的ICAM1、VCAM1和MCP-1mRNA的表達(dá)。
　　4.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以增加HUVEC細(xì)胞分泌MCP-1，阿托伐他汀可以降低ox-LDL誘導(dǎo)MCP-1的分泌。
　　結(jié)論:
　　ox-LDL可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，阿托伐他汀可以降低

9、ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　第二章阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的THP1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:觀(guān)察ox-LDL誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP1分泌TNF-α、IL-6和IL-1β的效應(yīng)，同時(shí)用阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察阿托伐他汀能否降低ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥分子的表達(dá)。
　　方法:
　　1.THP1細(xì)胞的培養(yǎng):復(fù)蘇THP1細(xì)胞，使用RPMI-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)及增殖活性。
　　2.M

10、TT法檢測(cè)ox-LDL對(duì)THP1細(xì)胞的增殖活性的影響。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組，培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對(duì)照;(2)ox-LDL刺激組(濃度為100μg/ml)，只添加ox-LDL;(3)阿托伐他汀組（1μM），只添加阿托伐他汀(4)阿托伐他汀(1M)+ox-LDL(100μg/ml)組。
　　4.Real-TimePCR檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)變化。
　　5.ELISA檢測(cè)THP1細(xì)胞分泌的

11、TNF-α、IL-6和IL-1β的變化
　　結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果表明0.5、1、2.5、5州的ox-LDL均未對(duì)THP1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生明顯影響。
　　2.Real-TimePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以升高TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表達(dá)，阿托伐他汀可以降低ox-LDL誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表達(dá)。
　　3.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以增加HUVEC細(xì)胞分