Caveolin-1在普伐他汀抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用.pdf

1、目的：研究caveolin-1在apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化形成過程中的變化。　　方法：取正常和apoE基因敲除小鼠(品系均為C57BL/6J)作為研究對象。實(shí)驗(yàn)分為四組，每組各8只：正常對照組；apoE敲除小鼠10周齡組；apoE敲除小鼠20周齡組；apoE敲除小鼠30周齡組；各組小鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，取血并處死各組動物，主動脈標(biāo)本作形態(tài)學(xué)觀察并計算主動脈橫斷面積、斑塊面積的變化。測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇

2、(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量。免疫組織化學(xué)染色法對主動脈Caveolin-1進(jìn)行半定量及定位分析。Western-blotting檢測Caveolin-1在主動脈的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)?！　〗Y(jié)果：apoE基因敲除小鼠的血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平與對照組比較顯著升高，并隨小鼠周齡增加而升高。TG水平由

3、1.54±0.19mmol/L上升到13.43±2.30mmol/L；TC水平由1.92±0.60mmol/L上升到35.78±4.90mmol/L；LDL水平則由0.90mmol/L上升到25.76±3.84mmol/L(P＜0.01)；斑塊面積及斑塊面積與主動脈面積的比值也隨小鼠周齡增加而增大，由0％上升到61.1±5.7％(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色法顯示與對照組比較，Caveolin-1在模型組血管內(nèi)膜表達(dá)呈陽性減弱，其程

4、度隨斑塊進(jìn)展有減少趨勢。同樣，免疫印跡檢測顯示模型組Caveolin-1的表達(dá)與對照組比較減弱，并與小鼠動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)?！　∧康模貉芯緾aveolin-1介導(dǎo)普伐他汀降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的作用，為他汀類藥物在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提供新思路。 方法：用不同濃度的普伐他汀(0μM、1μM、10μN(yùn)M、100μM)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1小時后，加入ox-LDL(80mg/L)同時孵育24小時。高效液相色譜法檢測細(xì)

5、胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的含量，并計算細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇的比值。油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況。Western-blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)。從而確定普伐他汀降低細(xì)胞膽固醇的最佳濃度，作出量效關(guān)系。然后以普伐他汀的最佳濃度預(yù)處理細(xì)胞1小時后，加入ox-LDL(80mg/L)同時孵育不同的時間，即0hr、6hr、12hr、24hr。高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的含量，并計算細(xì)胞內(nèi)膽

6、固醇酯與總膽固醇的比值。油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況。Western-blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)確定普伐他汀降低細(xì)胞膽固醇酯的最佳時間，作出時效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分為4組，即正常組、模型組(加入80mg/L的ox-LDL)、藥物組(加入最佳濃度的普伐他汀)、模型組加藥物(預(yù)處理最佳濃度的普伐他汀1小時后再加入80mg/L的ox-LDL)。油紅O染色觀察不同處理組細(xì)胞脂滴形成的情況。Weste

7、rn-blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞Caveolin-1蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測RAW264.7細(xì)胞caveolin-1mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)?！　〗Y(jié)果：經(jīng)不同濃度的普伐他汀(0μM、1μM、10μM、100μM)與ox-LDL4(80mg/L)共同處理的RAW264.7細(xì)胞24小時，結(jié)果顯示：在該濃度范圍內(nèi)，普伐他汀呈濃度依賴

8、性的降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯，同時caveolin-1的蛋白表達(dá)呈濃度依賴性的增加。將100μM的普伐他汀與ox-LDL(80mg/L)共同處理RAW264.7細(xì)胞0，6，12，24小時。結(jié)果顯示：在0至24小時范圍內(nèi)，普伐他汀呈時間依賴性的降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯，同時caveolin-1的蛋白表達(dá)呈時間依賴性的增加?！　榱诉M(jìn)一步研究普伐他汀降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與caveolin-1的相互關(guān)系。我們將實(shí)驗(yàn)重新分成4組，其中設(shè)定普伐他

9、汀直接處理正常的巨噬細(xì)胞組進(jìn)行比較。選定普伐他汀的最佳處理濃度100μM和最佳處理時間24小時。結(jié)果顯示：油紅O染色表明加用普伐他汀的處理組，細(xì)胞內(nèi)脂滴較泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴大大減少。普伐他汀處理組Caveolin-1蛋白表達(dá)較泡沫細(xì)胞組(僅用80mg/Lox-LDL進(jìn)行孵育)顯著增加(P＜0.01)，但caveolin-1的mRNA水平有輕微上升，無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：Caveolin-1可能參與了ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和