炎癥加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷及阿托伐他汀干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：炎癥加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷
　　 目的：探討炎癥是否加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟的損傷。
　　 方法：采用雄性C57BL/6小鼠，將小鼠隨機(jī)分為三組：普通飲食組（A1）、高脂飲食組（B1）、高脂+炎癥組（由皮下注射0.5ml10％酪蛋白（Casein）/隔天誘導(dǎo)）（C1）。14周后處死，檢測(cè)血清中IL-6、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。油紅“

2、O”染色及酶法檢測(cè)腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE、PAS、Masson染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。（Real-timePCR，RT-PCR.）實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)（IHC）分別檢測(cè)腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、Ⅳ型膠原（CollagenⅣ）的基因與蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：與B1組比較，C1組血清中的IL-6顯著升高（P<0.05），表明皮下注射Casein成功建立了

3、系統(tǒng)慢性炎癥小鼠模型。與A1組相比，B1組TC、LDL-C顯著升高（P<0.01）。與B1組比較，C1組的血清的TC、LDL-C水平顯著下降（P<0.05），而腎臟組織總膽固醇、膽固醇酯水平顯著升高（P<0.05），病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞的增生和系膜基質(zhì)的擴(kuò)張，GSI顯著增高（P<0.05）。RT-PCR及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥上調(diào)了TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅣ的表達(dá)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：炎癥狀態(tài)

4、下，血漿膽固醇水平并不與腎臟損害呈正相關(guān)。炎癥促進(jìn)血清里的膽固醇不斷進(jìn)入腎臟組織細(xì)胞，降低了血清中的脂質(zhì)水平，加重了脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷。
　　 第二部分：SREBP-LDLr/HMGCOA還原酶途徑在炎癥加重脂質(zhì)誘導(dǎo)腎臟損傷的作用
　　 目的：探討膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解蛋白（SCAP）-膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）-低密度脂蛋白受體（LDLr）/羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶（HMGCoA還原酶）途徑在炎癥

5、加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用。
　　 方法：在第一部分研究的動(dòng)物模型上，RT-PCR檢測(cè)SCAP，SREBP2、HMGCoA還原酶和LDLr基因水平，Western blot（WB）檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)量。有相關(guān)趨勢(shì)的變量采用Pearson相關(guān)分析。
　　 結(jié)果：與B2組相比，C2組SCAP，SREBP2、HMGCoA還原酶和LDLr基因與蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），并且HMGCoA還原酶和LDLr蛋白的表達(dá)與腎臟組

6、織沉積的膽固醇酯（CE）成正相關(guān)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：炎癥可以通過上調(diào)SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA還原酶的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇的合成和攝取，加重了脂質(zhì)在腎臟的沉積，加重誘導(dǎo)了腎臟的損傷。
　　 第三部分：炎癥加重SR-A/CD36/ApoE三敲小鼠脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷及主要機(jī)制
　　 目的：應(yīng)用SR-A/CD36/ApoE三敲除小鼠模型，旨在探討清道夫受體CD36、SR-A及LDLr在炎癥加

7、重脂質(zhì)介導(dǎo)的腎臟損傷的作用。
　　 方法：C57BL/6來源的雄性SR-A/CD36/ApoE三敲除小鼠，將小鼠隨機(jī)分為三組：普通飲食組（A2）、高脂飲食組（B2）、高脂+炎癥組（C2）。14周后處死，檢測(cè)血清中淀粉樣蛋白（SAA）、IL-6、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、TC、TG、LDL-C、和HDL-C水平。檢測(cè)尿蛋白/尿肌酐的水平。油紅“O”染色及酶法檢測(cè)腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE，PAS，Masson方法觀察腎臟形

8、態(tài)學(xué)改變。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a肌動(dòng)蛋白（a-SMA）、LDLr、SREBP2、SCAPmRNA表達(dá)。IHC與WB技術(shù)檢測(cè)TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA、LDLr、SREBP2-N、SCAP蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：C2組血清炎癥因子SAA，IL-6顯著高于B2及A2組，表明炎癥模型成功建立（P<0.05）。C2組血清中TC、

9、LDL-C、HDL-C顯著低于B2組（P<0.05），腎臟膽固醇，膽固醇酯的沉積卻顯著升高（P<0.05），血清Scr，BUN，尿蛋8/尿肌酐顯著升高（P<0.05）。腎臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)C2組腎小球基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞變性萎縮，蛋白管型及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，GSI、TII顯著高于B2組（P<0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥上調(diào)了腎臟CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA、TGF-β1、FN mRNA與蛋白的表達(dá)（P<0.

10、05）。炎癥還顯著促進(jìn)了LDLr、SCAP、SREBP2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：炎癥可以通過SREBP2-SCAP-LDLr途徑而非CD36/SR-A途徑促進(jìn)了脂質(zhì)從血清向腎臟的積聚，加重了脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損害。
　　 第四部分：阿托伐他汀非依賴降血脂的腎臟的保護(hù)作用
　　 目的：探討阿托伐他汀的腎臟保護(hù)作用及潛在機(jī)制。
　　 方法：在第三部分實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，采用SR-A/CD36

11、/ApoE三敲除小鼠設(shè)立高脂飲食+2mg/kg/d阿托伐他?。―1）組，以A1、A2組為對(duì)照，B2組為模型組。檢測(cè)血清IL-6、SAA的水平及脂質(zhì)水平。油紅“O”染色及酶法檢測(cè)’腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE，PAS，Masson染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。RT-PCR與IHC分別檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因與蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：與B2組比較，D1組顯著減少了腎臟組織膽固醇、

12、膽固醇酯沉積（P<0.05），顯著改善了蛋白尿與腎功能（P<0.05），但是血清中的TC、LDL-C水平無顯著的降低（P>0.05）。與B2組比較，D1組可以顯著減少高脂飲食誘導(dǎo)的腎臟組織系膜細(xì)胞的增生，系膜基質(zhì)的沉積等病理改變，GSI顯著降低（P<0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)D1組顯著降低了腎臟組織TGF-β1的基因與蛋白表達(dá)（P<0.05），進(jìn)而顯著降低FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因與蛋白表達(dá)（P<0.

13、05）。
　　 結(jié)論：阿托伐他汀可以不依賴于降血脂，而是通過降低腎臟組織TGF-β1，獨(dú)立于SRA、CD36受體途徑而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。
　　 第五部分：炎癥應(yīng)激導(dǎo)致他汀抵抗作用
　　 目的：本課題組體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明炎癥可以導(dǎo)致肝臟細(xì)胞對(duì)他汀藥物的抵抗，本部分將從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)是否影響阿托伐他汀的腎臟保護(hù)作用。
　　 方法：在第三部分實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，對(duì)高脂+炎癥模型的小鼠加用阿托伐他汀2mg/kg

14、/d（D2）和10mg/kg/d（D3）干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以A2、D1、B2、C2組為對(duì)照，酶法檢測(cè)血清的TC、LDL-C、TG、HDL-C水平與SAA、IL-6水平。HE、PAS、Masson染色方法觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變，酶法及油紅“O”染色檢測(cè)腎臟組織中膽固醇的沉積。RT-PCR檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：與C2組對(duì)比，D2、D3組不能有效降低血脂水平（P>

15、0.05）。與B2比較，D3組可以顯著降低血脂水平（P<0.05）。與C2組對(duì)比，D2組不能顯著的降低腎臟組織膽固醇的沉積、血清肌酐水平（P>0.05）及改善腎臟病理結(jié)構(gòu)的損傷，D3組可顯著降低腎臟組織膽固醇的沉積及改善腎臟的病理（P<0.05）。并且，D2組不能顯著降低CoilagenⅠ、CollagenⅣ基因的表達(dá)（P>0.05），而D3組能顯著降低FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA所有基因的表達(dá)（P<0.05

16、）。
　　 結(jié)論：炎癥影響阿托伐他汀腎臟保護(hù)作用的療效，在炎癥環(huán)境中要達(dá)到相同效果需要增大劑量。而導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的潛在機(jī)制值得進(jìn)一步探討。
　　 第六部分：重慶漢族兒童單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因多態(tài)性及表達(dá)水平與結(jié)核病易感性的關(guān)系
　　 目的：探討MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518A/G多態(tài)性、血清MCP-1蛋白表達(dá)水平與結(jié)核病的相關(guān)關(guān)系。
　　 方法：研究對(duì)象為100例兒童結(jié)核病、100例成人結(jié)核病以及相應(yīng)的2

17、00例健康對(duì)照。序列特異性引物PCR（PCR-SSP）技術(shù)檢測(cè)MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518A/G多態(tài)性。ELISA方法測(cè)定相應(yīng)不同基因型患者和對(duì)照血清MCP-1水平。
　　 結(jié)果：（1）總體結(jié)核病組2518GG基因型頻率為65％，明顯高于相應(yīng)的健康對(duì)照組（27％）（P<0.05）；（2）MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518位點(diǎn)GG基因型患結(jié)核病機(jī)率高于AA基因型，且兒童GG基因型發(fā)病的危險(xiǎn)性高于成人GG基因型（P<0.05）；（3）