VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能不全及炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、冠心?。╟oronary artery diseases，CAD）是一種常見的嚴(yán)重危害人們身心健康的疾病，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其病理生理基礎(chǔ)，研究表明內(nèi)皮功能不全及炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化形成的核心環(huán)節(jié)，但其機(jī)制尚未完全闡明。
　　血管過氧化物酶(Vascular peroxidase，VPO)是本課題組發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的過氧化物酶，其為過氧化物酶家族成員之一，與髓過氧化物酶(myeloperox

2、idase，MPO)具有高達(dá)44.5％的同源性，二者均可催化過氧化氫(H2O2)（弱氧化劑）成為次氯酸(HOCl)（強(qiáng)氧化劑）從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，與MPO主要由中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌不同，VPO主要存在于血管及心肌組織中，目前已證實(shí)VPO具有兩種亞型，VPO1和VPO2，在血管內(nèi)皮中的以VPO1表達(dá)為主。我們之前的研究證實(shí)冠心病患者血漿中VPO1濃度顯著升高，且與氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)呈明顯正相關(guān)。此外，VPO1基因

3、沉默后可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制NADPH gp91 phox蛋白表達(dá)，從而抑制ROS/p38MAPK/caspase-3通路有關(guān)，提示VPO1可能與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前VPO1在AS形成中的作用及機(jī)制尚不完全清楚。
　　因此，本研究擬探討VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能不全及炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制。本研究將有助于闡明VPO1的生物學(xué)功能，為研發(fā)新的抗動脈粥樣硬化藥物提供理論依據(jù)。

4、　　第一部分VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能不全中的作用及機(jī)制
　　目的:從分子細(xì)胞水平，運(yùn)用轉(zhuǎn)染VPO1 shRNA等分子生物學(xué)技術(shù)，探討VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能不全中的作用及其機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為兩個部分:(1)研究ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VPO1的表達(dá)。分組如下:量效實(shí)驗(yàn):分為4組:對照組和不同濃度的ox-LDL組（用含50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)

5、皮細(xì)胞24 h）。時效實(shí)驗(yàn):分為8組:不同時間的對照組（不加任何干預(yù)因素，用培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞0、12、24、48 h）和ox-LDL組(用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞0、12、24、48h)，提取細(xì)胞總蛋白，采用western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)VPO1的表達(dá)，采用熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)HOCl水平。(2)研究VPO1基因沉默對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO/eNOS/DDAH/ADMA系統(tǒng)及細(xì)胞內(nèi)HOCl生成的

6、影響。分組如下:分為6組:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時; VPO1 shRNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中，用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;Non-T sh RNA組:在內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Non-T shRNA（非特異性sh RNA）后，用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;

7、+VPO1 shRNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中，用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+Non-T sh RNA組:在內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Non-T shRNA（非特異性sh RNA）后，用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;提取細(xì)胞上清液檢測NO（氧化還原法）及ADMA含量（HPLC法），提取細(xì)胞總蛋白采用western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)eNOS/DDAH的表達(dá)，采

8、用熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)HOCl水平。
　　結(jié)果:
　　(1) ox-LDL顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VPO1蛋白表達(dá)及HOCl水平。
　　(2)與對照組相比，ox-LDL(100μg/ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24 h顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO生成、eNOS及DDAH表達(dá)，而VPO1基因沉默可逆轉(zhuǎn)ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞的上述抑制作用，轉(zhuǎn)染非特異性shRNA對ox-LDL的損傷作用無顯著影響。VPO1基因沉默的內(nèi)皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)染非特異性shRNA的內(nèi)皮

9、細(xì)胞，對細(xì)胞NO、eNOS及DDAH無顯著影響。
　　(3)與對照組相比，ox-LDL(100μg/ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24 h顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞上清液中ADMA含量，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)HOCl生成，VPO1基因沉默可顯著降低ox-LDL誘導(dǎo)的ADMA及HOCl水平，而轉(zhuǎn)染非特異性shRNA對ox-LDL誘導(dǎo)的ADMA及HOCl含量升高無顯著影響。VPO1基因沉默的內(nèi)皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)染非特異性shRNA的內(nèi)皮細(xì)胞，對細(xì)胞ADMA及HOCl含量無

10、顯著影響。
　　結(jié)論:(1)證實(shí)ox-LDL可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞VPO1表達(dá);(2)成功構(gòu)建VPO1基因沉默的內(nèi)皮細(xì)胞模型，并首次發(fā)現(xiàn)VPO1調(diào)控了ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO生成，其機(jī)制與HOCl/DDAH/ADMA/eNOS通路有關(guān)。
　　關(guān)鍵詞:血管過氧化物酶1;內(nèi)皮細(xì)胞;DDAH; ADMA; eNOS
　　第二部分VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制
　　目的:探討VPO1在ox-

11、LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為三個部分:(1) VPO1基因沉默對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;VPO1 sh RNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中，用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;Non-T sh RNA組

12、:在內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Non-T shRNA（非特異性sh RNA）后，用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+VPO1 shRNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中，用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+Non-T sh RNA組:在內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Non-T shRNA(非特異性sh RNA)后，用含100μ

13、g/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;提取細(xì)胞蛋白采用western-blot方法檢測ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK的蛋白表達(dá)。(2) HOCl對內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和P-selectin蛋白表達(dá)的影響。分為4組:對照組和不同濃度的HOCl組（用含3μM、10μM及30μM HOCl的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h），提取蛋白，采用western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)ICAM-1和P-sele

14、ctin的蛋白表達(dá)。(3) HOCl對內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB和p38MAPK的影響。分組如下:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;SB203580組:加入終濃度為20μM的SB203580（p38MAPK的特異性阻斷劑）孵育細(xì)胞1h后，用PBS繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時; PDTC組:加入終濃度為100μM的PDTC（NF-κB的特異性阻斷劑）孵育細(xì)胞1h后，用PBS繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時; HOCl組:用含3

15、0μM HOCl的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+SB203580組:加入終濃度為20μM的SB203580（p38MAPK的特異性阻斷劑）孵育細(xì)胞1h后，用含30μM HOCl的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+ PDTC組:加入終濃度為100μM的PDTC（NF-κB的特異性阻斷劑）孵育細(xì)胞1h后，用含30μM HOCl的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時。采用western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB和p38MAPK的蛋白表達(dá)。
　

16、　結(jié)果:
　　(1)與對照組相比，ox-LDL（100μg/ml）培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24 h顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而VPO1基因沉默可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞上述蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染非特異性shRNA對ox-LDL的促炎作用無顯著影響。VPO1基因沉默的內(nèi)皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)染非特異性shRNA的內(nèi)皮細(xì)胞，對細(xì)胞ICAM-1、P-select

17、in、NF-κB和p38MAPK蛋白表達(dá)無顯著影響。
　　(2)3μM、10μM及30μM HOCl孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h呈濃度依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和P-selectin蛋白表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(3)用含30μM HOCl的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時，可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB的蛋白表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，預(yù)先給予20μM SB20358