人乳頭瘤病毒11型全基因組轉基因小鼠基因元件的設計與構建.pdf

1、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）11型是人尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）的主要病原體之一。目前還沒有根治CA的有效手段，并且對其致病機理至今都還不太了解。一種理想的動物病理模型對致病機理的體內(nèi)研究和治療手段的臨床前評價都有重要意義。本課題的內(nèi)容就是設計并在質(zhì)粒上構建HPV11全基因組轉基因小鼠模型的外源基因。 HPV11在宿主體內(nèi)表達出病理蛋白的一個重要前提是其基因組

2、必須保持游離狀態(tài)，加之該基因?qū)ι掀ぜ毎膶Ｊ刃?，因此HPV11轉基因動物的外源基因除了應含有HPV11完整基因組外，還要包含能夠在轉基因鼠的上皮細胞，將HPV11切割下來的基因元件。 本課題首先根據(jù)HPV11的致病特點，結合成熟的Cre/LoxP可控表達技術設計轉基因的外源基因及其功能元件。主要思路是將完整開放讀碼框的HPV11基因組以3'—5'的順序置于正向連接的兩組LoxP序列中間，LoxP序列兩端分別連接真核細胞啟動子和E

3、GFP序列，當出現(xiàn)由上皮細胞啟動子啟動的Cre酶表達時，可使LoxP中間的HPV11基因組被切下，實現(xiàn)在小鼠體內(nèi)游離的自然致病狀態(tài)，同時LoxP殘基將啟動子和EGFP序列相連接，出現(xiàn)熒光。 實驗第一部分為質(zhì)粒構建。 本實驗室保存有含HPV11全序列的質(zhì)粒pBR322/HPV11，并獲得了一個適合于構建HPV11兩端功能序列的質(zhì)粒pQE—Trisystem。質(zhì)粒構建過程包括三個小部分。 第一部分，首先將HPV11全

4、基因組從pBR322/HPV11中切下，同時酶切質(zhì)粒pQE—Trisystem，并對回收產(chǎn)物去磷酸化。將回收的HPV11和去磷酸化后的pQE—Trisystem連接，連接產(chǎn)物轉化DH5a，做菌落PCR實驗以篩選出反向連接陽性克隆，得到的產(chǎn)物命名為質(zhì)粒A。 第二部分，首先從質(zhì)粒pIRE2—EGFP中擴增出LoxP—EGFP—PolyA序列，擴增同時加上酶切位點，接著對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒A進行酶切，回收酶切產(chǎn)物。然后將兩個回收產(chǎn)物相連接

5、，得到的產(chǎn)物命名為質(zhì)粒B。 第三部分，從pBR322/HPV11中擴增出LoxP—7931—7072序列，加上酶切位點，酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒B并回收。將兩個回收產(chǎn)物連接，轉化DH5a，做菌落PCR實驗以篩選出反向連接陽性克隆，得到質(zhì)粒構建最終產(chǎn)物，命名為質(zhì)粒C。 實驗第二部分對構建的序列的功能進行了初步的體外檢測。 首先從兒童包皮中分離出人皮膚角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）。在傳到第二代時，用脂質(zhì)體法

6、將質(zhì)粒C和表達Cre酶的質(zhì)粒pIC—Cre共轉染角質(zhì)形成細胞，并設對照組，觀察熒光蛋白表達情況，最后RT—PCR檢測HPV11早期基因E6的轉錄水平。 研究結果： 1．用核酸凝膠電泳和測序的方法驗證所構建的質(zhì)粒C與實驗設計的相符。 2．轉染入角質(zhì)形成細胞后實驗組觀察到熒光表達。 3．RT—PCR檢測HPV11E6在轉錄水平上的表達為陽性。 4．轉染的角質(zhì)形成細胞和對照組的角質(zhì)形成細胞相比，傳代次數(shù)