人乳頭瘤病毒檢測及分型基因芯片制備的初步研究.pdf

1、背景和目的:由于基因芯片技術(shù)可以對大量的生物樣品進行平行、快速、敏感、高效的基因分析,因而在DNA序列測定、基因表達分析、基因組研究、基因診斷、藥物研究與開發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛應用.近年來,隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟,其在病原微生物的基因診斷中也得到了廣泛應用,并對病原微生物的基因診斷起著革命性的影響.該實驗將基因芯片技術(shù)應用于HPV的檢測與分型,建立了一種新的HPV檢測與分型方法,探討了4種常見HPV(6,11,16,18)檢測及分型基

2、因芯片的制作方法,優(yōu)化確定了該芯片的最佳檢測條件.材料和方法:收集尖銳濕疣(50例)和宮頸癌(22例)石蠟包埋組織標本,用酚-氯仿抽提法從中提取DNA,用HPV-PCR檢測試劑盒對其進行HPV檢測,對結(jié)果陽性者進行純化、重組克隆,經(jīng)DNA序列測定,檢索GenBank,保留HPV6,11,16,18陽性克隆為標準品.根據(jù)HPV L1區(qū)基因序列特點,設(shè)計5條實驗組探針(HPV通用探針、HPV6,11,16,18型特異性探針各一條)和3條對照

3、組探針(與HPV沒有同源性的一段植物基因為陰性對照,一段乙肝基因片段為陽性對照,不含任何基因片段的空白點樣液為空白對照),用GMS 417 Arrayer點樣儀將其點樣至經(jīng)特殊處理過的玻片上,制成HPV檢測及分型基因芯片.采用PCR引物直接標記法和摻入法對HPV標準品進行擴增和熒光標記,將標記好的標準品與芯片在梯度溫度下(43℃,45℃,47℃,49℃,51℃)雜交1小時,用GMS 418 Array Scanner掃描儀對雜交后的芯片

4、進行掃描檢測分析,用ScanArray軟件對各信號點進行信號強度采集.采用SPSS10.0軟件對不同標記方法、不同雜交溫度下信號強度的差異性進行統(tǒng)計分析,兩組間比較采用t檢驗,以a=0.05為檢驗標準,確定該芯片的最佳雜交溫度和樣品的最佳標記方法.結(jié)論:1.該研究發(fā)現(xiàn),PCR引物直接標記法為理想的樣品標記方法;最佳雜交檢測溫度為47℃.2.該研究制作的HPV檢測及分型基因芯片是一種敏感、高效、快速、準確的HPV檢測及分型方法,可以成功地