Neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：本研究通過鑒定大鼠neurtin基因的轉(zhuǎn)錄本，利用顯微注射的方法獲得過表達(dá)大鼠neuritin基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為從系統(tǒng)生物學(xué)水平研究neuritin基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：1）利用比較基因組學(xué)分別設(shè)計(jì)與小鼠2個(gè)轉(zhuǎn)錄本同源的引物，采用RT-PCR的方法釣取大鼠neuritin基因。采用生物信息的方法對大鼠neuritin的序列同源性及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行全方位預(yù)測分析；2）構(gòu)建由CMV超強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大鼠neuriti

2、n基因表達(dá)的真核表達(dá)載體-pcDNA3.1(+)-neuritin,RT-PCR擴(kuò)增大鼠neuritin基因的編碼區(qū)，并在兩端引入 Xho-Ⅰ和 Nhe-Ⅰ酶切位點(diǎn)，對擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體雙酶切后連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒的雙酶切及測序篩選出重組的pcDNA3.1(+)-neuritin陽性質(zhì)粒；3）用受精卵雄原核顯微注射法制備 neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠:將pcDNA3.1(+)-neuritin質(zhì)粒用BglⅡ和

3、StuⅠ限制性內(nèi)切酶消化，回收純化約為2.3kb帶有Neurtin基因的片段。將純化后的片段顯微注射受精卵，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)，篩檢存活的胚胎，移植入假孕受體小鼠輸卵管,常規(guī)飼育。通過 PCR方法檢測出生小鼠基因組neuritin基因的插入和鼠尾組織中大鼠neuritin基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：1）大鼠只存在一個(gè)neuritin轉(zhuǎn)錄本，編碼142個(gè)氨基酸，與其他動(dòng)物的編碼序列高度同源；三級蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示大鼠Neuritin蛋

4、白富含α螺旋，其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)無異于人類Neuritin蛋白；2）成功地構(gòu)建了pcDNA3.1(+)–neuritin真核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切、測序后證實(shí)neuritin基因插入載體的多克隆位點(diǎn)Xho-Ⅰ和Nhe-Ⅰ酶切位點(diǎn)間；3）用原核顯微注射711枚受精卵,經(jīng)短暫體外培養(yǎng)存活275枚,存活率為38.67％,移植到30只受體鼠輸卵管中，受體鼠懷孕26只，共生產(chǎn)45只后代鼠（F0）。經(jīng)PCR檢測,初步證實(shí)其中3只為neuritin陽性整合