靛藍(lán)基因表達(dá)載體的構(gòu)建及香石竹CHS啟動(dòng)子克隆研究.pdf

1、在觀賞植物中藍(lán)色花普遍偏少,用作觀賞的切花香石竹、郁金香、月季、玫瑰等都缺乏藍(lán)色花系.該論文從克隆花瓣特異表達(dá)的啟動(dòng)子及與靛藍(lán)色素基因連接構(gòu)建表達(dá)載體等方面對(duì)藍(lán)色花基因工程育種進(jìn)行了一些研究,主要的研究?jī)?nèi)容有以下幾個(gè)方面:(1)利用Genbank公布的兩個(gè)擬南芥查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)啟動(dòng)子序列(AF248988和AF012810)設(shè)計(jì)序列特異性的引物,從擬南芥(Arabidopsisthialiana

2、,Columbia)基因組DNA中進(jìn)行PCR得到大小分別為533bp和2046bp的兩個(gè)啟動(dòng)子片段(其中小片段啟動(dòng)子是大片段啟動(dòng)子的3'端部分),經(jīng)過克隆測(cè)序證明與Genbank中公布的序列超過99％的同源性.將小片段啟動(dòng)子序列應(yīng)用PlantCARE軟件進(jìn)行分析,表明兩個(gè)序列均具有真核生物啟動(dòng)子普遍具有的CAAT box和TATA box等保守序列,并且具有一些CHS啟動(dòng)子特有的保守序列,證明兩個(gè)啟動(dòng)子序列應(yīng)該具有相應(yīng)的啟動(dòng)子活性.(2

3、)通過對(duì)兩個(gè)啟動(dòng)子序列以及載體序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建,以應(yīng)用于以后的遺傳轉(zhuǎn)化研究.大、小兩個(gè)啟動(dòng)子片段都分別與GUS基因或與Drewlo S等人從Ralstonia eutropha(真氧產(chǎn)堿桿菌)中克隆到的靛藍(lán)色素基因(bec基因)相連接,目的是分別用于鑒別相應(yīng)的啟動(dòng)子活性和在觀賞植物中啟動(dòng)靛藍(lán)色素基因的表達(dá).目前,小片段啟動(dòng)子的兩個(gè)表達(dá)載體的構(gòu)建已經(jīng)完成,并進(jìn)行了煙草的初步轉(zhuǎn)化研究;大片段啟動(dòng)

4、子載體的構(gòu)建正在進(jìn)行.(3)該課題的目的是得到能夠在觀賞植物中高效啟動(dòng)靛藍(lán)色素基因表達(dá)的載體,但是考慮到擬南芥的CHS啟動(dòng)子啟動(dòng)靛藍(lán)色素基因在觀賞植物中的表達(dá)可能會(huì)受到種屬特異性等一些因素的影響而不能很好的啟動(dòng)基因的表達(dá),該研究還進(jìn)行了從觀賞植物香石竹(Dianthus caryophyllus,Feraceseo)中克隆CHS啟動(dòng)子的研究.由于到目前為止還沒有見到有關(guān)香石竹中CHS啟動(dòng)子的報(bào)道,并且CHS啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的種屬特異性,在

5、不同種屬的植物之間具有很低的同源性,所以應(yīng)用CHS啟動(dòng)子序列之間的同源性進(jìn)行香石竹CHS啟動(dòng)子克隆的路線是不可行的.該文的研究通過CHS基因之間的同源性設(shè)計(jì)引物,從香石竹中進(jìn)行PCR并經(jīng)過克隆測(cè)序得到了三個(gè)CHS基因的5'端片段,經(jīng)過Blast分析證明了它們具有很高的同源性.然后利用銜接頭PCR的方法進(jìn)行了香石竹CHS啟動(dòng)子克隆的初步研究,得到了約500bp和800bp的PCR產(chǎn)物,目前克隆測(cè)序工作正在進(jìn)行.進(jìn)一步的工作將進(jìn)行啟動(dòng)子缺失