大豆查爾酮合成酶基因克隆、表達及其在雪蓮提取液中代謝產(chǎn)物分析.pdf

1、查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)是植物次生代謝途徑中黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，僅分布于高等植物中，在植物的抗菌機制、抗脅迫、細胞的發(fā)育和分化、花色素的積累和外源基因的表達等方面起著重要的作用。 本實驗以中國大豆為材料，利用PCR方法克隆查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)全基因，采用SOE法克隆得到去掉內(nèi)含子的查爾酮合成酶基因，構(gòu)建pET-GMCHS工程表達質(zhì)粒，通過大腸桿菌E.co

2、li BL21(DE3)高效表達系統(tǒng)表達大豆CHS。將有活力的E.coli BL21(DE3)-<'GMCHSEX>工程菌株導入雪蓮提取液中培養(yǎng)，采用液相色譜和質(zhì)譜分析培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物，分析結(jié)果表明有新的黃酮類物質(zhì)合成。這對研究黃酮和異黃酮的合成提供了可靠的證據(jù)，為我們深入開展對植物次生代謝途徑的研究，奠定了一定的基礎。取得主要結(jié)果如下： 1. 采用CrAB法從我國北方大豆(Glycine max L.Merr.)栽培品種春大

3、豆系列(北豐12)幼芽中提取大豆總。DNA，以此為模板，經(jīng)PCR反應獲得編碼查爾酮合成酶的全基因，采用SOE法去掉查爾酮合成酶基因中的一個內(nèi)含子。測序后核酸序列分析表明，去掉內(nèi)含子后的基因(CHS-exon)編碼區(qū)長1170bp，編碼390個氨基酸，與已報道的CHS的cDNA序列同源率達到97％。 2. 構(gòu)建表達載體pET-GMCHS-exon，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)得到工程菌株，工程菌經(jīng)IPTG(1.5mmol/

4、L)誘導，通過12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，獲得了分子量在42.9KD的一條蛋白質(zhì)特異表達帶，此蛋白質(zhì)特異表達帶經(jīng)過飛行質(zhì)譜分析，與肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)比對結(jié)果表明重組蛋白即查爾酮合成酶(CHS)獲得高效表達。 3. 將有活力的E.coli BL21(DE3)-<'GMCHSEX>工程菌株導入雪蓮提取液中培養(yǎng)，采用液相色譜和質(zhì)譜分析大腸桿菌E. coli BL21(DE3)高效表達系統(tǒng)在雪蓮提取液中的代謝產(chǎn)物，樣