p55PIK對結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要分兩部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分
　　p55PIK對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　目的:了解結(jié)腸癌細(xì)胞系 p55PIK的表達(dá)水平,及干預(yù) p55PIK的表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法:1、用western blot檢測了結(jié)腸癌細(xì)胞系中的p55PIK的表達(dá)水平。2、構(gòu)建 p55PIK高表達(dá)的載體 pcDNA3-p55PIK,通過轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染入 HT29及SW480細(xì)胞系后,構(gòu)建兩個穩(wěn)

2、定高表達(dá) p55PIK的細(xì)胞系。同時構(gòu)建低表達(dá)質(zhì)粒 pLKO1.0-sh-p55PIK并其包裝成慢病毒,構(gòu)建低表達(dá) p55PIK的穩(wěn)定細(xì)胞系。3、用單細(xì)胞克隆形成實驗和BrdU摻入法來檢測細(xì)胞的克隆形成能力和DNA合成能力的變化。用劃痕實驗和Transwell實驗檢測穩(wěn)定細(xì)胞系的運動能力。4、用裸鼠結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的模型在體內(nèi)驗證p55PIK對結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移能力是否有影響。
　　結(jié)果:發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌原位病灶來源的HT29、HCT116及

3、SW480細(xì)胞中p55PIK表達(dá)極低,腹腔內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶來源的SW620稍高,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶來源的LoVo細(xì)胞中p55PIK有明顯表達(dá)。并且成功構(gòu)建了高表達(dá) p55PIK的細(xì)胞系 HT29-p55PIK、SW480-p55PIK,及低表達(dá) p55PIK的LoVo-si-p55PIK細(xì)胞系,同時構(gòu)建了含空載體的對照細(xì)胞,并經(jīng)western blot驗證正確?？寺⌒纬蓪嶒炛?SW480對照細(xì)胞形成克隆的平均直徑是945.8±156.8μm,而

4、高表達(dá)組是1348.3±181μm,明顯增高(p=0.0067);而HT29細(xì)胞中,對照組克隆的平均直徑是381.7±37μm,高表達(dá)組是644.3±148.5μm,也明顯比對照增高(p=0.009)。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)高表達(dá) p55PIK組的SW480細(xì)胞的平均遷移距離在12小時是127±6.65μm,對照細(xì)胞組是73.3±28.6μm。24小時高表達(dá)組是214±3μm,對照組是156±40μm。高表達(dá) p55PIK組在12小時的時間點是對

5、照細(xì)胞組的1.7倍(p=0.03),24小時則是對照的1.46倍(p=0.046)。而在 Transwell實驗中, SW480對照組48小時的平均200X視野遷移數(shù)是162±26個,高表達(dá) p55PIK組為371±28個;侵襲實驗中,對照組48小時的平均200X視野遷移數(shù)是96±30個,高表達(dá)組為157±23個,高表達(dá)組在遷移和侵襲實驗中分別是對照的2.29倍(p=0.009)和1.63倍(p=0.003),遷移和侵襲能力增強(qiáng);低表達(dá)

6、 p55PIK的LoVo細(xì)胞24小時遷移實驗中,低表達(dá) p55PIK的LoVo細(xì)胞的遷移個數(shù)(30±14)明顯比對照組(58±7)低,是對照細(xì)胞的51.7％(p=0.004)遷移能力降低。在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中,高表達(dá)p55PIK的SW480組細(xì)胞有兩例發(fā)生肉眼可見的肝轉(zhuǎn)移灶,對照組未見肉眼可見的肝轉(zhuǎn)移灶。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)移灶來源的結(jié)腸癌細(xì)胞系的p55PIK表達(dá)量較高,且高表達(dá) p55PIK可使結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29和SW480的運動及

7、侵襲能力增強(qiáng),還可以使 SW480的克隆形成能力增強(qiáng);而低表達(dá) p55PIK后可以使 LoVo細(xì)胞的運動能力減弱。高表達(dá) p55PIK的SW480在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移到肝臟能力的增強(qiáng)。
　　第二部分
　　p55PIK影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制
　　目的:研究 p55PIK影響侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及針對 p55PIK的靶向干預(yù)作用。
　　方法:1.利用realtimePCR技術(shù)檢測 p55PIK表達(dá)對轉(zhuǎn)移有關(guān)的胞內(nèi)因子或胞外

8、因子的mRNA的影響。2.用Elisa法來檢測是否有對應(yīng)的相關(guān)因子蛋白的變化。3.通過熒光報告基因技術(shù)和western blot技術(shù)分析了可能與 p55PIK有關(guān)系的,同時也是和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因 NF-κB的激活是否發(fā)生了變化。4.用N24靶向干預(yù) p55PIK,通過 transwell和劃痕試驗檢測其對細(xì)胞運動能力的作用。
　　結(jié)果:SW480細(xì)胞高表達(dá) p55PIK后,realtimePCR發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子 PDGF-A的mRN

9、A水平是對照的3.9±2倍(p=0.042),HT29為1.7±0.2倍(p=0.04),TNF-α是的mRNA變化是3.2±0.5倍(SW480,p=0.004)和1.9±0.45倍(HT29,p=0.02),高表達(dá)組明顯升高。而Elisa結(jié)果表明高表達(dá) p55PIK可以促進(jìn) TNFα的表達(dá)升高了1.8倍(SW480, p=0.0002和1.75倍(SW480,p=0.003),在蛋白水平上證實了高表達(dá) p55PIK促進(jìn) TNFα的分

10、泌,熒光報告基因系統(tǒng)提示使 p55PIK高表達(dá)后 SW480的NF-κB對下游基因的轉(zhuǎn)錄活性是對照組的1.9±0.25倍(p=0.0002),而HT-29細(xì)胞中p55PIK高表達(dá)后是對照組的1.5±0.2倍(p=0.009)。而使 LoVo細(xì)胞的p55PIK低表達(dá)后, NF-κB的活性對照組的47±5％(p=0.002),明顯受到抑制。而且 western blot結(jié)果證實 p65的536位磷酸化水平也同時降低。使用p55PIK靶向干預(yù)

11、藥物 N24后,劃痕實驗中,空白組、對照肽組(Cp)、N24組在12小時的遷移距離分別為93.7±11μm、75.7±17.5μm和20.7±6.1μm,24小時后的遷移距離為137.7±24.5μm、109±20.9μm和45.3±5.9μm,N24組比空白組明顯降低(12小時 p=0.0005,24小時 p=0.003,n=3),比對照組也明顯降低(12小時 p=0.0005,24小時 p=0.003,n=3);在 Transwel

12、l遷移實驗中,空白組200倍視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)為205±20個,Cp組為213±15個,N24組為125±45個,N24組相對于空白組(p=0.02,n=3)和Cp組(p=0.01,n=3)明顯降低,侵襲實驗中,空白組200倍視野下平均侵襲細(xì)胞數(shù)為123±26個,Cp組為102±20個,N24組為60±20個,N24組比對照組(p=0.002)和Cp組(p=0.005)明顯下降。
　　結(jié)論:p55PIK通過影響 NF-κB通路和