p55PIK對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要分兩部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分
　　p55PIK對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　目的:了解結(jié)腸癌細(xì)胞系 p55PIK的表達(dá)水平,及干預(yù) p55PIK的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法:1、用western blot檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞系中的p55PIK的表達(dá)水平。2、構(gòu)建 p55PIK高表達(dá)的載體 pcDNA3-p55PIK,通過(guò)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染入 HT29及SW480細(xì)胞系后,構(gòu)建兩個(gè)穩(wěn)

2、定高表達(dá) p55PIK的細(xì)胞系。同時(shí)構(gòu)建低表達(dá)質(zhì)粒 pLKO1.0-sh-p55PIK并其包裝成慢病毒,構(gòu)建低表達(dá) p55PIK的穩(wěn)定細(xì)胞系。3、用單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和BrdU摻入法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力和DNA合成能力的變化。用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)能力。4、用裸鼠結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的模型在體內(nèi)驗(yàn)證p55PIK對(duì)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移能力是否有影響。
　　結(jié)果:發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌原位病灶來(lái)源的HT29、HCT116及

3、SW480細(xì)胞中p55PIK表達(dá)極低,腹腔內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶來(lái)源的SW620稍高,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的LoVo細(xì)胞中p55PIK有明顯表達(dá)。并且成功構(gòu)建了高表達(dá) p55PIK的細(xì)胞系 HT29-p55PIK、SW480-p55PIK,及低表達(dá) p55PIK的LoVo-si-p55PIK細(xì)胞系,同時(shí)構(gòu)建了含空載體的對(duì)照細(xì)胞,并經(jīng)western blot驗(yàn)證正確?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中,SW480對(duì)照細(xì)胞形成克隆的平均直徑是945.8±156.8μm,而

4、高表達(dá)組是1348.3±181μm,明顯增高(p=0.0067);而HT29細(xì)胞中,對(duì)照組克隆的平均直徑是381.7±37μm,高表達(dá)組是644.3±148.5μm,也明顯比對(duì)照增高(p=0.009)。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá) p55PIK組的SW480細(xì)胞的平均遷移距離在12小時(shí)是127±6.65μm,對(duì)照細(xì)胞組是73.3±28.6μm。24小時(shí)高表達(dá)組是214±3μm,對(duì)照組是156±40μm。高表達(dá) p55PIK組在12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)是對(duì)

5、照細(xì)胞組的1.7倍(p=0.03),24小時(shí)則是對(duì)照的1.46倍(p=0.046)。而在 Transwell實(shí)驗(yàn)中, SW480對(duì)照組48小時(shí)的平均200X視野遷移數(shù)是162±26個(gè),高表達(dá) p55PIK組為371±28個(gè);侵襲實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組48小時(shí)的平均200X視野遷移數(shù)是96±30個(gè),高表達(dá)組為157±23個(gè),高表達(dá)組在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中分別是對(duì)照的2.29倍(p=0.009)和1.63倍(p=0.003),遷移和侵襲能力增強(qiáng);低表達(dá)

6、 p55PIK的LoVo細(xì)胞24小時(shí)遷移實(shí)驗(yàn)中,低表達(dá) p55PIK的LoVo細(xì)胞的遷移個(gè)數(shù)(30±14)明顯比對(duì)照組(58±7)低,是對(duì)照細(xì)胞的51.7％(p=0.004)遷移能力降低。在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中,高表達(dá)p55PIK的SW480組細(xì)胞有兩例發(fā)生肉眼可見的肝轉(zhuǎn)移灶,對(duì)照組未見肉眼可見的肝轉(zhuǎn)移灶。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的結(jié)腸癌細(xì)胞系的p55PIK表達(dá)量較高,且高表達(dá) p55PIK可使結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29和SW480的運(yùn)動(dòng)及

7、侵襲能力增強(qiáng),還可以使 SW480的克隆形成能力增強(qiáng);而低表達(dá) p55PIK后可以使 LoVo細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力減弱。高表達(dá) p55PIK的SW480在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移到肝臟能力的增強(qiáng)。
　　第二部分
　　p55PIK影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制
　　目的:研究 p55PIK影響侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及針對(duì) p55PIK的靶向干預(yù)作用。
　　方法:1.利用realtimePCR技術(shù)檢測(cè) p55PIK表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)移有關(guān)的胞內(nèi)因子或胞外

8、因子的mRNA的影響。2.用Elisa法來(lái)檢測(cè)是否有對(duì)應(yīng)的相關(guān)因子蛋白的變化。3.通過(guò)熒光報(bào)告基因技術(shù)和western blot技術(shù)分析了可能與 p55PIK有關(guān)系的,同時(shí)也是和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因 NF-κB的激活是否發(fā)生了變化。4.用N24靶向干預(yù) p55PIK,通過(guò) transwell和劃痕試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的作用。
　　結(jié)果:SW480細(xì)胞高表達(dá) p55PIK后,realtimePCR發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子 PDGF-A的mRN

9、A水平是對(duì)照的3.9±2倍(p=0.042),HT29為1.7±0.2倍(p=0.04),TNF-α是的mRNA變化是3.2±0.5倍(SW480,p=0.004)和1.9±0.45倍(HT29,p=0.02),高表達(dá)組明顯升高。而Elisa結(jié)果表明高表達(dá) p55PIK可以促進(jìn) TNFα的表達(dá)升高了1.8倍(SW480, p=0.0002和1.75倍(SW480,p=0.003),在蛋白水平上證實(shí)了高表達(dá) p55PIK促進(jìn) TNFα的分

10、泌,熒光報(bào)告基因系統(tǒng)提示使 p55PIK高表達(dá)后 SW480的NF-κB對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性是對(duì)照組的1.9±0.25倍(p=0.0002),而HT-29細(xì)胞中p55PIK高表達(dá)后是對(duì)照組的1.5±0.2倍(p=0.009)。而使 LoVo細(xì)胞的p55PIK低表達(dá)后, NF-κB的活性對(duì)照組的47±5％(p=0.002),明顯受到抑制。而且 western blot結(jié)果證實(shí) p65的536位磷酸化水平也同時(shí)降低。使用p55PIK靶向干預(yù)

11、藥物 N24后,劃痕實(shí)驗(yàn)中,空白組、對(duì)照肽組(Cp)、N24組在12小時(shí)的遷移距離分別為93.7±11μm、75.7±17.5μm和20.7±6.1μm,24小時(shí)后的遷移距離為137.7±24.5μm、109±20.9μm和45.3±5.9μm,N24組比空白組明顯降低(12小時(shí) p=0.0005,24小時(shí) p=0.003,n=3),比對(duì)照組也明顯降低(12小時(shí) p=0.0005,24小時(shí) p=0.003,n=3);在 Transwel

12、l遷移實(shí)驗(yàn)中,空白組200倍視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)為205±20個(gè),Cp組為213±15個(gè),N24組為125±45個(gè),N24組相對(duì)于空白組(p=0.02,n=3)和Cp組(p=0.01,n=3)明顯降低,侵襲實(shí)驗(yàn)中,空白組200倍視野下平均侵襲細(xì)胞數(shù)為123±26個(gè),Cp組為102±20個(gè),N24組為60±20個(gè),N24組比對(duì)照組(p=0.002)和Cp組(p=0.005)明顯下降。
　　結(jié)論:p55PIK通過(guò)影響 NF-κB通路和