LSD1調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選及鑒定.pdf

1、第一部分、LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因的篩選
　　目的：利用人類基因表達(dá)譜芯片和ChIP技術(shù)探測結(jié)腸癌細(xì)胞中LSD1調(diào)控的下游靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。
　　方法：
　?。?）細(xì)胞系培養(yǎng):人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、HT-29細(xì)胞來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞研究中心。10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基作為SW620細(xì)胞的培養(yǎng)液;10%胎牛血清的RPMI1640培基作為HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)液。
　?。?

2、）細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：構(gòu)建、合成LSD1過表達(dá)載體及siRNA-LSD1有效片段，脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染LSD1-siRNA入SW620細(xì)胞，脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染LSD1過表達(dá)載體入HT-29細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組，A組：結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620, B組：SW620+negative control(NC)，C組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-siRNA的SW620細(xì)胞（SW620+LSD1-siRNA)，G1組：結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，G2組：HT

3、-29+negative control(NC)，G3組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-overexpression的HT-29細(xì)胞（HT-29+LSD1-overexpression）。
　　（3）利用人類基因表達(dá)譜芯片獲取LSD1高表達(dá)導(dǎo)致的結(jié)腸癌細(xì)胞基因表達(dá)改變集：通過對六個實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組進(jìn)行基因芯片檢測。根據(jù)log2(ratio)與p-value(Differentially expressed)的大小可挑選有顯著差異表現(xiàn)的探針確定差異表

4、達(dá)基因{有顯著差異表達(dá)的條件為|log2(Ratio)|>=1 and P-value(Differentially expressed)＜0.05}。
　?。?）Real-time PCR及Western blot驗(yàn)證：隨機(jī)選取其中10個靶基因，利用Real-time RT-PCR、Western Blot在結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、HT-29細(xì)中驗(yàn)證是否與基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果吻合。
　?。?）利用生物信息學(xué)技術(shù)確定與轉(zhuǎn)移相

5、關(guān)的靶基因，利用Gene Ontology的分類和聚類分析,按照其參與的生物學(xué)過程（Biological Process）和分子功能（MolecularFunction）進(jìn)行了功能分類，確定與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因。再利用Pathway Studio數(shù)據(jù)庫分析每個因子的作用通路，顯示LSD1及轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因在已知信號通路中的位置，揭示LSD1與靶基因在整個信號通路中的相互作用關(guān)系，并選擇最有意義的基因進(jìn)行后續(xù)研究。
　　結(jié)果：

6、　　（1）基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示，具備篩選標(biāo)準(zhǔn)(篩選條件為log2|Fold change|≥1且 P＜0.05)的差異表達(dá)基因共有8275個,其中明顯上調(diào)的基因有3633個，基因明顯下調(diào)的差異表達(dá)基因有4642個。為保證結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步使LSD1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29中過表達(dá)（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1基因的全長cDNA序列至HT-29細(xì)胞），重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證上述差異表達(dá)的基因，結(jié)果顯示，符合篩選標(biāo)準(zhǔn)(同上)的差異表達(dá)基因共有8

7、287個，其中4047個基因明顯上調(diào)，4240個基因明顯下調(diào)。
　?。?）通過進(jìn)一步篩選我們得到1528個在實(shí)驗(yàn)組和對照組表達(dá)差異在3倍以上的基因,在sw620細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組(C/A)及對照組(C/B)同時表達(dá)的差異表達(dá)基因數(shù)為101個（log2|Fold change|≥3且 P＜0.05）。在HT-29細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組(G3/G1)和對照組(G3/G2)同時表達(dá)的差異表達(dá)基因數(shù)為106個（log2|Fold change|≥3且

8、 P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)組(C/A)中差異表達(dá)基因?yàn)楦弑磉_(dá)（或低表達(dá)），同時在實(shí)驗(yàn)組(G3/G1)中為低表達(dá)（或高表達(dá)）的差異表達(dá)基因數(shù)為20個（log2|Fold change|≥3且P＜0.05）。通過比對分析，我們篩選出以下20個LSD1調(diào)控的下游靶基因：CDH1、ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14、VAV1、AKR1B1、CENPA、F2R、NFIB、NR4A2、MAGEA6|MAGEA3、CABYR、F

9、OXF2、NELL2、TLE4、COPZ2、SLC9A2、STAP-2。
　　（3）Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明下游靶基因CABYR、FOXF2、NELL2和TLE4在實(shí)驗(yàn)組SW620+LSD1-siRNA中mRNA高表達(dá)（P＜0.05），在實(shí)驗(yàn)組HT-29+LSD1-overexpression中mRNA低表達(dá)（P＜0.05）。而下游靶基因ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14和VAV1則在實(shí)驗(yàn)

10、SW620+LSD1-siRNA中mRNA顯著低表達(dá)（P＜0.05），在實(shí)驗(yàn)組HT-29+LSD1-overexpression中mRNA顯著高表達(dá)（P＜0.05），結(jié)果表明靶基因在轉(zhuǎn)錄水平RNA的相對表達(dá)量變化趨勢與芯片篩選的差異表達(dá)基因相對表達(dá)量變化趨勢相一致。在蛋白水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)目的基因的Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果重復(fù)了基因芯片結(jié)果的變化趨勢。以上驗(yàn)證結(jié)果表明芯片篩選結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。
　?。?）對差異表達(dá)倍

11、數(shù)排序前十的差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology和Pathways顯著性分析，結(jié)果顯示在GO注釋與功能分類報告對應(yīng)的差異表達(dá)基因中,與分子功能相關(guān)有6930條;與生物學(xué)過程相關(guān)的有2878條;和細(xì)胞組分有關(guān)的有7306條；在分子功能中,87.27%的差異表達(dá)基因與苷酸結(jié)合相關(guān)，其次為ATP結(jié)合相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相關(guān);在生物學(xué)過程中,有59.97%的差異表達(dá)基因與細(xì)胞內(nèi)分子及蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)的,另外比例較高的有細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等

12、;在細(xì)胞組分方面,29.65%的差異表達(dá)基因與非膜結(jié)合細(xì)胞器相關(guān),細(xì)胞膜相關(guān)占16.25%; KEGG信號通路富集分析，表明排序前十的差異表達(dá)基因主要參與p53信號通路、癌癥信號通路、泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解、軸突導(dǎo)向信號通路、氨基酰-tRNA合成酶、小細(xì)胞肺癌、細(xì)胞周期、嘧啶代謝、B細(xì)胞受體信號通路、慢性粒細(xì)胞白血病。
　　(5)利用生物信息學(xué)技術(shù)（Gene Ontology, Pathway studio）進(jìn)一步確定 LSD1調(diào)控

13、的影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的，并與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生相關(guān)的靶基因。并選擇了相應(yīng)的具有代表性意義的4個基因CABYR、FOXF2、TLE4、CDH1進(jìn)行后續(xù)的研究。
　　結(jié)論：（1）利用基因表達(dá)芯片對靶向沉默LSD1基因的SW620結(jié)腸癌細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-過表達(dá)載體的HT-29細(xì)胞進(jìn)行基因檢測。在這兩種癌細(xì)胞株中探測到大量差異表達(dá)的基因（明顯上調(diào)或下調(diào)），提示 LSD1調(diào)控的下游靶基因在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮重要作

14、用。
　?。?）確定了能影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶基因即可確定為結(jié)腸癌中受 LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因。通過比對分析在結(jié)腸癌細(xì)胞株中篩選出的CABYR、FOXF2、TLE4、CDH14個基因的差異表達(dá)與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為后面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分、探討LSD1調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　目的：探討結(jié)腸癌細(xì)胞是否通過改變LSD1與其下游靶基因的結(jié)合豐度，繼而下調(diào)靶基因啟動子區(qū)域H3k

15、4、H3k9的甲基化水平而影響靶基因的表達(dá)，結(jié)合人類基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果，進(jìn)一步確定LSD1表觀遺傳修飾的下游靶基因。從而初步闡明LSD1影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探討LSD1調(diào)控表觀遺傳修飾的可能機(jī)制。
　　方法：選擇前期研究篩選出的4個靶基因（CABYR、FOXF2、T LE4、CDH1）利用LSD1、H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me單克隆抗體，分離出與其結(jié)合的潛在LSD1下游靶基因啟動子，PC

16、R檢測該啟動子區(qū)域，普通半定量PCR的強(qiáng)度代表目的基因啟動子的豐度，同時也代表H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me強(qiáng)度。通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)分別檢測每個靶基因的6個實(shí)驗(yàn)組即A. SW620細(xì)胞(空白對照),B.SW620細(xì)胞+NC-siRNA(陰性照),C.SW620細(xì)胞+LSD1-siRNA，G1.HT-29細(xì)胞(空白對照),G2.HT-29細(xì)胞+ NC空白載體(陰性對照),G3.HT-29細(xì)胞+

17、 LSD1過表達(dá)載體，檢測內(nèi)容包括：①LSD1與其下游靶基因啟動子區(qū)域的結(jié)合豐度；②LS D1下游靶基因啟動子區(qū)域組蛋白H3第4位賴氨酸的二甲基(H3K4m e2)和一甲基(H3K4me)水平，以及組蛋白H3第9位賴氨酸的二甲基(H3K9me2)和一甲基(H3K9me)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）LSD1與下游靶點(diǎn)靶基因啟動子結(jié)合的分析結(jié)果:LSD1低表達(dá)組（LSD1-siRNA）和LSD1過表達(dá)組（HT-29+LSD1-

18、overexp ression）均與靶基因CABYR的啟動子區(qū)域結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復(fù)合體，且下調(diào)LSD1可增加目的基因CABYR的表達(dá)水平，增加幅度比較明顯（P＜0.01），而過表達(dá)LSD1可降低目的基因CABYR的表達(dá)水平。低表達(dá)LSD1組（LSD1- siRNA）和過表達(dá)組（HT-29+LSD1-overexpression）均與靶基因CDH1(E-cad)的啟動子區(qū)域結(jié)合能夠產(chǎn)生D NA-蛋白復(fù)合體，且結(jié)果提示低表達(dá)LSD1

19、可一定程度上增加目的基因CDH1的表達(dá)水平（P＜0.01），過表達(dá)LSD1可降低目的基因CDH1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，靶基因FOXF2、TLE4的CHIP組未見條帶，上調(diào)或下調(diào)LSD1均對目的基因FOXF2、TLE4的表達(dá)水平無明顯影響，即LSD1可能并未直接調(diào)控FOXF2、TLE4基因。
　?。?）下游靶基因表達(dá)水平與組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平結(jié)果分析：低表達(dá)LSD1組（LSD1-siRNA）明顯增加靶基因CABYR啟動

20、子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），低表達(dá)LSD1對CABYR啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。低表達(dá)LSD1明顯增加靶基因CDH1(E-cad)啟動子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），而對CDH1(E-cad)啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。
　　過表達(dá)組（HT-29+LSD1-overexpression）對下游靶基因啟動子區(qū)域H3K4me1/2甲基化有明顯作用,過

21、表達(dá)LSD1明顯降低靶基因CABYR啟動子區(qū)H3K4me1（P＜0.05）、H3K4me2（P＜0.01）甲基化程度，上調(diào)LSD1對CABYR啟動子區(qū)域H3K9me/2甲基化無影響。上調(diào)LSD1顯降低靶基因CDH1(E-cad)啟動子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），對CDH1(E-cad)啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。
　　CHIP結(jié)果顯示，上調(diào)或下調(diào)LSD1并不改變靶基因FOXF2和TLE4總

22、的H3K9me1/2與H3K4me1/2的甲基化水平。
　　結(jié)論：
　　（1）在人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620細(xì)胞中，LSD1與其表觀遺傳修飾的下游靶基因CABYR和CDH1(E-cad)基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me2甲基化水平呈負(fù)相關(guān),而在HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞株中LSD1與其表觀遺傳修飾的下游靶基因CABYR基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me1/2甲基化水平呈正相關(guān)，與CDH1(E-cad)基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me2甲基化

23、水平呈正相關(guān)。同時證明了CABYR和CDH1(E-cad)基因?yàn)榕c轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因，其表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)可能是影響結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的原因。
　?。?）闡明了結(jié)腸癌細(xì)胞是通過改變LSD1與其下游靶基因的結(jié)合豐度，繼而下調(diào)靶基因啟動子區(qū)域H3K4me1、H3K4me2的甲基化水平而影響靶基因的表達(dá)，這為進(jìn)一步研究LSD1影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分、驗(yàn)證LSD1調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

24、>　　目的：在細(xì)胞水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，通過驗(yàn)證的能影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶基因即可確定為結(jié)腸癌中受 LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因。
　　方法：分別利用侵襲性較強(qiáng)的SW620細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，各自分為為3個組，未處理組(blank)、陰性對照組(scramble)和處理組（轉(zhuǎn)染siRNA），即以未轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞（A組）和轉(zhuǎn)染空載體SW620細(xì)胞組（B組：SW620細(xì)胞+轉(zhuǎn)染空載體組

25、）作為對照，處理組（C組：SW620細(xì)胞+siRNA-CABYR/CDH1）通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默靶基因的表達(dá)，利用Transwell細(xì)胞體外遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：在通過沉默靶基因（siRNA-CABYR）處理的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中,與陰性對照處理組細(xì)胞相比,其侵襲能力(40.00±4.06vs69.50±2.25，68.50±5.02; P＜0.05)均顯著減弱。在通過沉

26、默靶基因（siRNA-CDH1）處理的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中，與陰性對照處理組細(xì)胞相比,其侵襲能力(116.25±4.38vs59.50±3.84，58.25±4.82; P＜0.05)均顯著增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染 siRNA-CABYR基因組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞與對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組）細(xì)胞相比較，其侵襲能力有減弱。轉(zhuǎn)染 siRNA- CDH1基因組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞與對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組）細(xì)胞相比較，其侵襲能力有增強(qiáng)。