磷脂酶Cγ1在大腸癌細(xì)胞遷移和細(xì)胞—基質(zhì)粘附中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、該課題以大腸癌細(xì)胞為研究模型，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)的技術(shù)手段，研究了PLCγ1與大腸癌細(xì)胞與基質(zhì)粘附、PLCγ1與大腸癌細(xì)胞的遷移能力間的關(guān)系及其發(fā)揮作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期為闡明大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找治療的靶位點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 該研究首先利用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX2構(gòu)建了人PLCγ1編碼區(qū)cDNA真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負(fù)突變片段PLCz的真核表達(dá)載體pLNCX2/PLC

2、z，經(jīng)PCR，限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列測(cè)定鑒定后，轉(zhuǎn)染至人大腸癌細(xì)胞LoVo中，并在mRNA及蛋白水平檢測(cè)了PLCγ1及PLCz的表達(dá)。同時(shí)，利用PLC特異抑制劑U73122，分別研究了PLCγ1功能活性的抑制對(duì)人大腸癌細(xì)胞粘附及細(xì)胞遷移能力的影響。最后，該研究采用蛋白印跡(Westernblot)，凝膠遷移率變動(dòng)分析(gelelectrophoresismobilityshiftassay，EMSA)，免疫細(xì)胞化學(xué)，酶譜分析及

3、RT-PCR(reversetranscriptionPCR)等技術(shù)，進(jìn)一步分析了大腸癌細(xì)胞在表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)刺激作用下PLCγ1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移作用的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，及其對(duì)下游相關(guān)信號(hào)分子的活性和表達(dá)的影響。 主要結(jié)果和結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了人PLCγ1基因全長編碼區(qū)cDNA真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負(fù)突變片段PLCz的真核表達(dá)載體p

4、LNCX2/PLCz。所構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)PCR，限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列測(cè)定證明是正確的。經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67，以產(chǎn)生的病毒感染LoVo細(xì)胞。經(jīng)RT-PCR及蛋白印跡分析顯示，與未轉(zhuǎn)染組、pLNCX2轉(zhuǎn)染組及pLNCX2/PLCz轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染pLNCX2/PLCγ1的LoVo細(xì)胞中PLCγ1的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有明顯增高。在pLNCX2/PLCz轉(zhuǎn)Ⅱ染組中除可檢

5、測(cè)到內(nèi)源性PLCγ1的表達(dá)外，還有外源性顯性負(fù)突變片段PLCz的表達(dá)，而在其它各組中則不能檢測(cè)到PLCz的表達(dá)。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人PLCγ1基因全長編碼區(qū)cDNA真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負(fù)突變片段PLCz的真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCz，且構(gòu)建的兩種真核表達(dá)載體均可以在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)，從而為進(jìn)一步研究PLCγ1在大腸癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2.該實(shí)驗(yàn)采用體外損傷愈合分析進(jìn)一步研究了PLC

6、γ1對(duì)于高轉(zhuǎn)移的LoVo細(xì)胞體外遷移能力的影響。結(jié)果顯示，用不同劑量的PLC抑制劑U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理也可顯著降低LoVo細(xì)胞的遷移能力。與對(duì)照組遷移率(100％)相比，不同劑量的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理可使細(xì)胞的遷移率((實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))％)分別降到88.49±2.68％，69.91±0.97％，41.62±3.59％(P＜0.05)，亦呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性的下降。

7、說明，在高轉(zhuǎn)移大腸癌細(xì)胞中，細(xì)胞與基質(zhì)的粘附及細(xì)胞的遷移能力均受到PLCγ1的調(diào)節(jié)。 3.實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了EGF是否在PLCγ1對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和粘附能力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。不同劑量的EGF(5nM,10nM,20nM)處理細(xì)胞后，蛋白印跡分析顯示，EGF可通過對(duì)PLCγ1的磷酸化而激活PLCγ1，且表現(xiàn)出劑量依賴性，提示在大腸癌細(xì)胞中存在激活的EGFR-PLCγ1信號(hào)通路。其中20nMEGF處理后，PLCγ1的磷酸化水平增加最顯著

8、，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用20nMEGF處理細(xì)胞。粘附分Ⅲ析及體外損傷愈合分析顯示，在LoVo細(xì)胞中，EGF可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)纖連蛋白的粘附和細(xì)胞的遷移，而且，EGF對(duì)U73122在細(xì)胞與基質(zhì)粘附及細(xì)胞遷移方面的抑制效應(yīng)有一定的拮抗作用。 4.該實(shí)驗(yàn)對(duì)于NF-κB在大腸癌細(xì)胞粘附和遷移中的作用，及PLCγ1與NF-κB之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。不同濃度的NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，P

9、DTC)(50μM，100μM，150μM，200μM)處理LoVo細(xì)胞后，細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附呈現(xiàn)出劑量依賴性的下降。OD450從對(duì)照組的2.148±0.094分別下降至1.587±0.328，1312±0.192，1.115±0.177，0.961±0.151(P＜0.05)。同時(shí)，PDTC處理也可抑制細(xì)胞的遷移，而EGF則可以部分恢復(fù)PDTC所造成的細(xì)胞遷移率的下降。此外，EMSA和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了EGF對(duì)NF-κB的

10、激活部分依賴于PLCγ1。 5.該實(shí)驗(yàn)研究了LoVo細(xì)胞中PLCγ1和NF-κB對(duì)Hsp70表達(dá)的影響。細(xì)胞經(jīng)過不同的處理： (1)用不同濃度的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理。 (2)用不同濃度的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理30min后，再以EGF(20nM)刺激30min。 (3)以U73122(2.5μM)處理不同時(shí)間(0，0.5，1，4，8，12h)。 (4

11、)以PDTC(100μM)處理不同時(shí)間(0，0.5，1，4，8，12h)。提取不同處理組細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)Hsp70的表達(dá)。蛋白印跡分析顯示，抑制PLCγ1和NF-κB均可上調(diào)Hsp70的表達(dá)，但抑制效應(yīng)有所不同。抑制PLCγ1對(duì)Hsp70表達(dá)的上調(diào)作用持續(xù)時(shí)間較長，從抑制劑作用30min后開始，直到抑制劑作用12h，Hsp70表達(dá)仍高于對(duì)照組。抑制NF-κB后，抑制劑作用30min后，Hsp70表達(dá)同樣增高，但在4h后即恢復(fù)至對(duì)照水平。

12、考慮到NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，受到多種分子的調(diào)節(jié)，推測(cè)這種差異可能是由于其它的信號(hào)分子在一定程度上彌補(bǔ)了PDTC對(duì)NF-κB的抑制作用，從而導(dǎo)致Hsp70的表達(dá)較快恢復(fù)至正常水平。 6.該實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR及酶譜分析的方法對(duì)這二者的表達(dá)及活性進(jìn)行了研究。LoVo細(xì)胞經(jīng)不同濃度的PLCγ1抑制劑U73122或NF-κB抑制劑PDTC處理30min后，再在有或無20nMEGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。提取不同處理的LoVo細(xì)

13、胞的RNA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明，EGF，U73122，PDTC對(duì)MMP-2和TIMP-2在mRNA水平的表達(dá)無顯著影響。利用該實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的人PLCγ1基因編碼區(qū)cDNA真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγi顯性負(fù)突變片段PLCz的真核表達(dá)載體pLNCX2/PLCz轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行RT-PCR，也證實(shí)了這一結(jié)論。同時(shí)，酶譜分析證實(shí)，EGF，U73122，PDTC對(duì)MMP-2酶原的表達(dá)及激活也無顯著的調(diào)節(jié)作用

14、。因此，MMP-2，TIMP-2不是EGFR-PLCγ1-NF-κB信號(hào)通路的下游分子。 綜合結(jié)果提示，在高轉(zhuǎn)移的人大腸癌細(xì)胞與基質(zhì)的粘附及細(xì)胞的遷移中，PLCγ1均作為一個(gè)重要的信號(hào)分子發(fā)揮作用，并可能通過影響細(xì)胞的粘附及運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EGF可以通過磷酸化PLCγ1進(jìn)一步調(diào)節(jié)NF-κB的活性，共同參與這一過程。同時(shí)，Hsp70位于EGFR-PLCγ1-NF-κB信號(hào)通路的下游，受其負(fù)調(diào)節(jié)。而MMP-2，