家蠶嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTD1的結(jié)構(gòu)與功能.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferases，GSTs，EC2.5.1.18)是一種多功能的超家族酶，廣泛存在于哺乳動物、昆蟲、植物、真菌以及細菌等好氧生物體中。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)是重要的第二相解毒酶，其主要功能是對異生質(zhì)或內(nèi)源的有毒物質(zhì)進行代謝，從而達到解毒目的。除此外，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶還具有許多其它的功能。例如，具有過氧化酶功能，能在氧化應(yīng)激環(huán)境中保護有機體;還具有異構(gòu)酶功能;參與細胞生物

2、信號通路及生物合成方面。此外，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶能非催化性的結(jié)合和轉(zhuǎn)運大量內(nèi)源或異生的成分。
　　 有一類嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在牛、大鼠、煙草天蛾、棉鈴蟲和柑橘鳳蝶中報道。該類酶在嗅覺系統(tǒng)中推測的功能:一方面對有毒物質(zhì)進行代謝解毒以保護嗅覺組織;另一方面參與嗅覺進程。
　　 家蠶delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有4個成員，其中BmGSTd1在NCBI登錄為從家蠶觸角克隆得到，其編碼氨基酸與煙草天蛾中鑒定的觸

3、角特異GST-msolfl在序列相似性上達到74.4％，并且在已有報道的進化樹分析上，家蠶BmGSTd1、BmGSTd4與煙草天蛾的GST-msolfl聚為一簇?；谶@些線索，從家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶鑒定嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，并進行相關(guān)功能研究。
　　 本研究，從家蠶五齡第3天幼蟲不同組織的基因芯片數(shù)據(jù)分析出發(fā)，結(jié)合RT-PCR從家蠶delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的4個成員中鑒定了家蠶嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

4、候選基因BmGSTd1和BmGSTd4。同時，對家蠶BmGSTd1進行了克隆和分析;利用原核表達、蛋白純化等技術(shù)獲得了家蠶BmGSTD1重組蛋白;利用結(jié)構(gòu)生物學手段解析了BmGSTD1不結(jié)合底物和結(jié)合底物谷胱甘肽的晶體結(jié)構(gòu)，并對活性位點進行分析;利用分光光度法和薄層層析法進行了功能研究。
　　 本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.家蠶嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的鑒定
　　 從NCBIGenBank下載家蠶BmGS

5、Td1、BmGSTd2和BmGSTd3的基因全長序列，并在家蠶基因組上進行BlastN比對獲取3個基因的基因芯片探針號?；诩倚Q五齡第3天不同組織芯片數(shù)據(jù)分析，家蠶BmGSTd1在頭部高量表達，在精巢少量表達。BmGSTd2基因在雌雄頭、脂肪體、中腸、血液和前中部絲腺中有表達。BmGSTd3基因在除絲腺外其它組織中具有表達。
　　 進一步進行RT-PCR驗證。RT-PCR檢測結(jié)果，在五齡第3天幼蟲各組織中，家蠶BmGSTd1基因

6、在雌雄頭部、觸角和下顎須表達，而其它組織沒有表達;BmGSTd2和BmGSTd3基因在雌雄各個組織表達均有表達。BmGSTd4基因在各個組織中都未檢測到表達。在成蟲蛾各組織中，家蠶BmGSTd1基因在雄蛾觸角中高量表達，在足、尾鞘和生殖腺有微量表達，在雌蛾觸角中特異高量表達;BmGSTd2基因在雄蛾中各個組織都有表達，在雌蛾中除脂肪體外各個組織中都有表達;BmGSTd3基因表達情況和BmGSTd2基因相似;BmGSTd4基因只在雄蛾觸角

7、特異高量表達，在雌蛾各個組織中都沒有表達。
　　 2.家蠶嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分析
　　 家蠶BmGSTd1與BmGSTd4基因都在第6號染色體同一scaffold上，兩者轉(zhuǎn)錄方向相同。BmGSTd1的ORF長為657bp，編碼218個氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為25.2kDa，等電點為5.16，不含有信號肽;BmGSTd4的ORF長為738bp，編碼245個氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為27.7kDa，等電點為

8、4.63，含有信號肽。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示BmGSTD1和BmGSTD4均具有完整的谷胱甘肽N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。
　　 BmGSTD1和BmGSTD4氨基酸序列相似性為61.2％，兩者與煙草天蛾GST-msolf1氨基酸序列相似性分別為74.4％和59.1％。BmGSTD1和BmGSTD4與已報道的嗅覺相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對結(jié)果顯示從第50位氨基酸殘基開始，序列趨于保守，特別是第50位至第190位的氨基酸殘基，其中

9、部分殘基高度保守。BmGSTD與已解析結(jié)構(gòu)的昆蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的delta和epsilon亞家族氨基酸序列比較保守，特別是活性位點的氨基酸殘基，包括催化關(guān)鍵殘基。氨基酸序列特征分析顯示BmGSTD1和BmGSTD4具有完整的二級結(jié)構(gòu)基序。
　　 3.家蠶BmGSTD1的原核表達和純化
　　 為了進一步研究基因功能，根據(jù)BmGSTd1的ORF序列設(shè)計引物進行克隆，將得到的ORF全長片段亞克隆到原核表達載體p28，經(jīng)過

10、雙酶切鑒定和測序獲得了原核重組表達質(zhì)粒p28-BmGSTd1。重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，在以加入終濃度為0.2mM的IPTG，37℃培養(yǎng)4h誘導(dǎo)表達條件下獲得了可溶性形式表達產(chǎn)物，并且特異條帶在25kDa位置處，與目的蛋白預(yù)測分子質(zhì)量大小相一致，獲得了重組表達的BmGSTD1可溶蛋白。通過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析純化原核表達的重組BmGSTD1蛋白。以同樣的方法獲得了重組BmGSTD2和BmG

11、STD3蛋白。純化后的蛋白濃縮后，保存在-80℃用于后續(xù)實驗。
　　 4.家蠶BmGSTD1的功能
　　 以1-氯-2，4-二硝基苯為底物，通過分光光度法測定重組家蠶BmGSTD1的酶活性參數(shù)為:結(jié)合常數(shù)Km=0.28mM，最大反應(yīng)速度Vmax=456.47μmol/mg/min。與已報道的家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶對1-氯-2，4-二硝基苯酶動力學參數(shù)比較，重組家蠶BmGSTD1具有很好的結(jié)合常數(shù)和最大反應(yīng)速度，說明其具

12、有較好的GST活性，暗示其可能參與有毒物質(zhì)的代謝解毒。以氣味分子反-2-己烯醛和反苯丙烯醛為底物，在100mMNaAc，pH4.5(10％DMF)緩沖液條件下，利用薄層層析法鑒定了BmGSTD1能催化GSH與這兩種氣味分子反應(yīng)。家蠶BmGSTd1基因在家蠶嗅覺器官中占優(yōu)勢表達，除了具有很好的GST活性，還能催化氣味分子與谷胱甘肽反應(yīng)，根據(jù)這些結(jié)果推測BmGSTD1在家蠶嗅覺系統(tǒng)的作用是:一方面是對有毒物質(zhì)進行解毒以保護嗅覺器官;一方面是

13、作為清道夫?qū)M入細胞內(nèi)的氣味分子進行清理，維持嗅覺系統(tǒng)的敏感性和高效性。
　　 5.家蠶BmGSTD1的晶體結(jié)構(gòu)解析
　　 將純化獲得的重組BmGSTD1蛋白濃縮至4mg/mL，利用懸滴氣象擴散法，1μL蛋白溶液(含10mMDTT)與1μL蛋白結(jié)晶下槽液(含100mMNaAc，pH4.6，8％pEG4000)在16℃靜置一天，獲得了BmGSTD1不結(jié)合底物的晶體。為了獲得BmGSTD1結(jié)合底物谷胱甘肽的晶體，在同樣條件下

14、加入5mM谷胱甘肽。獲得的晶體在上海光源用X-射線衍射后收集衍射數(shù)據(jù)，衍射數(shù)據(jù)用HKL2000處理。以大劣按蚊AdGSTD5的結(jié)構(gòu)(PDBID:1R5A)為模型利用分子置換獲得BmGSTD1不結(jié)合底物結(jié)構(gòu)正確的解，再利用REFMAC和WinCoot進行結(jié)構(gòu)模型精修。BmGSTD1結(jié)合底物谷胱甘肽的以精修后的BmGSTD1不結(jié)合底物結(jié)構(gòu)為模型，進行同樣處理。最后獲得了家蠶BmGSTD1不結(jié)合底物和結(jié)合底物谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)。最終分辨率分別為2

15、.51A和2.12A。
　　 家蠶BmGSTD1結(jié)構(gòu)上活性形式是二聚體，衍射數(shù)據(jù)中顯示一個非對稱單元中存在4個分子，推測是蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中晶體堆積造成。二聚體結(jié)構(gòu)中，兩個亞基通過α3、α4、α5、β4的一側(cè)和α2與β3之間的柔性區(qū)域上的氨基酸殘基的相互作用形成作用界面。二聚體的界面包埋面積接近2800A2。
　　 家蠶BmGSTD1整體結(jié)構(gòu)，屬于經(jīng)典的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)。每個亞基可分為兩個獨立的結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域是

16、βαβαββα拓撲基序的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)，C端是由5個α螺旋以右手螺旋構(gòu)成的獨立結(jié)構(gòu)域，兩者之間由一短的柔性區(qū)域連接。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)中其它的相同特征在家蠶BmGSTD1結(jié)構(gòu)中也存在，如順式構(gòu)象的Pro58，引起α4螺旋中間斷裂的Gly107。
　　 組成家蠶BmGSTD1的谷胱甘肽結(jié)合位點的氨基酸殘基比較保守，大部分是親水性和極性的，它們通過氫鍵作用對谷胱甘肽進行結(jié)合和穩(wěn)定。其中的Ser14與谷胱甘肽的巰基形成3.65A