膽汁淤積時(shí)肝臟谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶A1-A4表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制研究.pdf

1、膽汁淤積(Cholestasis)是一種臨床常見的綜合癥，指肝臟合成、排泌膽汁發(fā)生障礙，膽汁成分在肝細(xì)胞中堆積，并進(jìn)一步導(dǎo)致血液中膽汁成分含量異常升高。膽汁淤積時(shí)，一方面疏水性毒性膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)積聚，導(dǎo)致肝功能損害、肝纖維化、肝硬化、肝癌，甚至死亡;另一方面，肝細(xì)胞通過(guò)自身復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子、核受體、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、解毒酶網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控膽汁酸的合成、攝取、排泌、解毒等，以降低積聚的毒性膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞的損傷，即肝臟產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。目前對(duì)于膽汁淤積的

2、基礎(chǔ)研究主要聚焦于膽汁酸的合成、攝取以及排泌等方面，對(duì)于肝臟如何降低疏水性膽汁酸毒性及其分子機(jī)制尚不清楚。
　　谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase，GSTs)是體內(nèi)重要的Ⅱ相解毒酶之一，也是肝臟有效適應(yīng)性反應(yīng)重要執(zhí)行者之一。通過(guò)催化膽汁酸谷胱甘肽化，增加其水溶性，降低毒性。GSTA超家族作為胞漿GSTs家族中重要的一員，在代謝內(nèi)外源性毒性化合物中發(fā)揮著主要作用。GSTA通過(guò)催化底物（包括膽汁酸、

3、膽紅素在內(nèi)的，多種內(nèi)外源性毒性化合物）中的親電子基團(tuán)與谷胱甘肽(glutathione，GSH)軛合而降低底物毒性，同時(shí)增加水溶性，更易于排出細(xì)胞。同時(shí)，GSTA在抗脂質(zhì)過(guò)氧化中也起著不可或缺的作用。其中，GSTA1在催化疏水性底物軛合GSH，抑制JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用;GSTA4通過(guò)自身α9螺旋處Y212殘基，以氫鍵結(jié)合4-HNE的醛基，進(jìn)而高效催化GSH與4-HNE軛合，生成GS-HE，間接發(fā)揮抗凋亡和調(diào)控分

4、化、增殖的作用。但近期有研究報(bào)道，人阻塞性膽汁淤積時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)GSTs解毒酶表達(dá)下調(diào)。顯然，這將削弱肝臟對(duì)毒性膽汁酸的處理能力，加重肝細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致膽汁淤積治療失敗，尤其是在導(dǎo)致膽汁淤積的病因不能去除時(shí)。然而，目前對(duì)膽汁淤積下這些解毒酶表達(dá)下調(diào)的研究不多，涉及的分子機(jī)制仍不清楚。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成纖維細(xì)胞(3T3-L1 adipocytes)中，腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor alpha TNF

5、α)與Gsta4可能存在負(fù)相關(guān)。而現(xiàn)已明確，膽汁淤積時(shí)TNFα顯著升高。這些研究結(jié)果提示，膽汁淤積時(shí)TNFα可能對(duì)GSTA1/A4的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，但目前并無(wú)研究證實(shí)并闡述機(jī)制。
　　目的：
　　本研究擬從HepG2細(xì)胞和大鼠水平，探討TNFα對(duì)GSTA1/A4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1.1 構(gòu)建過(guò)表達(dá)鈉離子-?；悄懼峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium tauroch

6、olate cotransportingpolypeptide，NTCP)的HepG2細(xì)胞。
　　1.2 分別以非結(jié)合膽汁酸，膽酸(cholic acid，CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholicacid，CDCA)處理HepG2細(xì)胞;結(jié)合膽汁酸T-CA(taurine cholic acid)、G-CA(glycinecholic acid)、T-CDCA以及G-CDCA，處理過(guò)表達(dá)NTCP的HepG2細(xì)胞。用蛋白免

7、疫印跡(Western blot)檢測(cè)GSTA1/A4蛋白表達(dá)。
　　1.3 以TNFα刺激HepG2細(xì)胞，qPCR(Real-time quantitative polymerase chainreaction)和Western blot分別檢測(cè)GSTA1/A4mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　1.4 TNFα刺激HepG2細(xì)胞后，Western blot分別檢測(cè)NF-κB和Nrf2蛋白水平表達(dá)。
　　1.5 NF-κB

8、信號(hào)通路抑制劑BAY11-7082((E)-3-[4-methylphenylsulfonyl]-2-propenenitrile)與TNFα共同處理HepG2細(xì)胞，qPCR和Western blot分別檢測(cè)GSTA1/A4mRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　將42只7-8周齡的SD(Sprague Dawley)大鼠隨機(jī)分成膽道結(jié)扎(bile duct-ligated，BDL)組和假手術(shù)組（Sham組），每組

9、各21只。Sham組動(dòng)物僅接受開腹手術(shù)，并在膽總管下方放置手術(shù)線，不結(jié)扎膽總管即關(guān)腹。BDL組動(dòng)物結(jié)扎膽總管后關(guān)腹。術(shù)后第3、7和14天，分別將Sham組和BDL組大鼠行安樂(lè)死，各7只/組/次，收集肝臟組織，剪成小塊，提取總RNA、蛋白。利用qPCR檢測(cè)Gsta2-4和Gstm1-4表達(dá)情況;免疫共沉淀(co-immunoprecipit ation)研究NF-κB、Nrf2與CBP(CREB—binding protein)之間的相互

10、作用;染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)檢測(cè)Nrf2與Gsta1基因啟動(dòng)子區(qū)域抗氧化反應(yīng)元件(the antioxidant-response element—ARE)結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.HepG2細(xì)胞中，CA、CDCA、T-CA、T-CDCA、G-CA、G-CDCA等膽汁酸未直接下調(diào)GSTA1/A4表達(dá)。
　　2.TNFα刺激HepG2細(xì)胞后，GSTA

11、1/A4的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均明顯下降，且呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系。
　　3.TNFα刺激HepG2細(xì)胞后，核內(nèi)p65蛋白含量及胞漿中磷酸化p65蛋白含量明顯升高，提示NF-κB信號(hào)通路激活;同時(shí)，胞漿Nrf2蛋白含量無(wú)明顯變化。
　　4.BAY11-7082抑制NF-κB信號(hào)通路后，TNFα對(duì)GSTA1/A4表達(dá)的抑制作用明顯減弱。
　　5.BDL組大鼠肝臟Gsta2-4、Gstm1、Gstm2以及Gstm4的m

12、RNA表達(dá)較Sham組顯著下降。
　　6.相對(duì)于Sham組，BDL組大鼠肝組織中NF-κB與CBP結(jié)合增多;同時(shí)，Nrf2與CBP結(jié)合減少。
　　7.相對(duì)于Sham組，BDL組大鼠肝組織中Nrf2與Gsta1基因啟動(dòng)子區(qū)域ARE結(jié)合減少。
　　結(jié)論：
　　本研究在HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CA、CDCA、T-CA、T-CDCA、G-CA、G-CDCA等膽汁酸并未直接下調(diào)GSTA1/A4表達(dá)。TNFα以劑量、時(shí)間依賴效

13、應(yīng)，在GSTA1/A4的mRNA水平和蛋白水平抑制其表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種抑制作用是TNFα通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)。在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)BDL大鼠肝組織內(nèi)多個(gè)Gst酶表達(dá)下調(diào);其次，通過(guò)co-immunoprecipitation和ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CBP，導(dǎo)致Nrf2與Gsta1基因啟動(dòng)子區(qū)域ARE結(jié)合減少，從而干擾了Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。綜上所述，本研究揭示了膽汁淤積時(shí)GSTA1/A4表達(dá)下調(diào)