納秒脈沖電場對腫瘤生長的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 癌癥是一個涉及全身系統(tǒng)的一大類疾病的統(tǒng)稱。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，癌癥是全世界人類死亡的主要原因，僅在2008年約有7，600,000人死于癌癥(占所有死亡人數(shù)的13％)，而預(yù)計死于癌癥的人數(shù)將會繼續(xù)增加，在2030年將超過11，000,000。一種應(yīng)用高能量脈沖電場的新型技術(shù)已經(jīng)從軍事應(yīng)用轉(zhuǎn)入生物醫(yī)學(xué)研究，目前主要應(yīng)用納秒脈沖電場(nanosecond pulsed electric filed，nsP

2、EF)作為抑制癌癥的新方法。在這個研究中，我們通過體外細(xì)胞學(xué)實驗和體內(nèi)腫瘤學(xué)實驗，從癌癥特征的治療靶標(biāo)入手，包括誘導(dǎo)凋亡、抑制增生、降低侵襲和轉(zhuǎn)移，來探索納秒脈沖電場(nsPEF)的抗腫瘤作用及其可能的分子機制。
　　 研究方法：
　　 采用胰腺癌(PANC-1)細(xì)胞開展體外實驗，并分別用不同強度(0,20,40和60kV/cm)的nsPEF來治療胰腺癌細(xì)胞。處理后的細(xì)胞分別孵育0,0.5，1，2，24，48和72小時，

3、采用排除臺盼藍(lán)染色陽性法來計數(shù)有活力的細(xì)胞，進(jìn)而計算細(xì)胞活力度；采用CCK-8細(xì)胞增殖實驗來計算細(xì)胞增殖的抑制率。通過凋亡相關(guān)的DNA梯度法、細(xì)胞TUNEL染色法、細(xì)胞透射電鏡和凋亡的細(xì)胞流式檢測法來鑒定細(xì)胞凋亡。通過細(xì)胞PI染色法來分析細(xì)胞周期的改變。通過細(xì)胞的Trans-well方法來檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過Western-blot方法來確定凋亡相關(guān)蛋白、NF-κB信號通路蛋白、以及MMP-9的蛋白表達(dá)情況。此外，肝癌細(xì)胞(H

4、epG2)通過皮下注射進(jìn)入裸鼠體內(nèi)，建立荷瘤小鼠模型，開展體內(nèi)實驗研究。每周觀察裸鼠的機體情況和腫瘤的生長情況。當(dāng)腫瘤體積約1cm3時，采用nsPEF對腫瘤進(jìn)行治療。實施荷瘤小鼠的MRI活體成像來觀察在體的腫瘤大小。腫瘤細(xì)胞植入后約6.5周，所有小鼠實施安樂死，并比較腫瘤體積。然后，采用腫瘤的H&E染色、TUNEL染色和透射電鏡來觀察腫瘤的改變，進(jìn)而探討腫瘤縮小的可能機制。
　　 研究結(jié)果：
　　 NsPEF在體外可以顯

5、著降低癌細(xì)胞的數(shù)量和活力度。它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為DNA大片段的形成、TUNEL陽性率的增高、線粒體變性和凋亡小體的形成。隨著nsPEF強度的增加，細(xì)胞主要表現(xiàn)為從早期凋亡至晚期凋亡，甚至細(xì)胞壞死，同時伴隨Caspase-3蛋白的高表達(dá)和抗凋亡蛋白如Mcl-1、Bcl-2等的低表達(dá)。NsPEF可以抑制癌細(xì)胞的增生，阻滯細(xì)胞周期于G2期，這可能與nsPEF引起的NF-κB信號通路的抑制有關(guān)。同時nsPEF也可以通過抑制NF-κB信號通路和

6、降低MMP-9的蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，我們的體內(nèi)實驗通過觀察腫瘤生長曲線、腫瘤的MRI活體成像、腫瘤體積和大體解剖的比較，證明了nsPEF可以明顯抑制腫瘤的生長。通過腫瘤組織的H&E染色發(fā)現(xiàn)nsPEF處理后出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的皺縮、血管破壞和白細(xì)胞浸潤；通過腫瘤組織的TUNEL染色和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　 研究結(jié)論：
　　 NsPEF在體外具有降低癌細(xì)胞數(shù)量和活力度的生物學(xué)作用，這不僅

7、表現(xiàn)為引起細(xì)胞凋亡，而且抑制細(xì)胞增生。NsPEF在體外通過依賴線粒體的內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。NsPEF在體外通過抑制NF-κB信號通路而負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增生。NsPEF也可以在體外通過抑制NF-κB信號通路來降低MMP-9的蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，nsPEF在體內(nèi)可能是通過誘導(dǎo)凋亡、破壞腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。總之，nsPEF在體外和體內(nèi)通過誘導(dǎo)凋亡、抑制增生、降低侵襲和