瘤內緩釋治療對小鼠腫瘤抑制作用的機制探討.pdf

1、研究目的： 理想的腫瘤治療方法是使抗腫瘤藥以一定的濃度和時間在腫瘤組織內充分發(fā)揮作用，同時減少藥物的毒副作用。常規(guī)的全身性系統(tǒng)化療往往無法在腫瘤組織中達到有效的藥物濃度，而加大藥物劑量勢必會增加了一定的毒副作用，從而使機體不能耐受。因此為增強抗腫瘤藥的作用，已有許多研究通過將抗腫瘤藥注入實體腫瘤內，使腫瘤組織長時間與高濃度的抗腫瘤藥接觸，從而提高了治療腫瘤的療效。在此基礎上，我們利用腫瘤組織作為藥物載體形成藥物緩釋庫，將有效的化

2、療藥物結合緩釋液及半抗原二硝基苯(DNP)進行腫瘤內的緩釋治療，通過提高藥物在腫瘤部位的作用，加強對腫瘤細胞的殺傷能力以及刺激機體免疫應答，從而達到更加有效的治療腫瘤的目的。 研究方法： 實驗動物C57BL/6小鼠，雌雄各半，周齡6～8周，體重18～22g，無菌環(huán)境中飼養(yǎng)。B16黑色素瘤細胞用RPMI1640(含10﹪FCS)培養(yǎng)，37℃，5﹪CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，約2～4天傳代。選取對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細胞造模

3、，此時細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳。將制備好的濃度為2×10<'6>個/ml瘤液取0.2 ml于無菌條件下皮下注射接種于小鼠左前肢腋下，一般在接種后5～6天時腫瘤生長至符合實驗要求，隨機分組進行初次治療，0.2ml/只，依次為①生理鹽水對照組，瘤內注射NS；②Ara-c對照組，瘤內注射Ara-c；③單純緩釋治療組，瘤內注射Ara-C+緩釋液；④免疫緩釋治療組，瘤內注射Ara-c+緩釋液+DNP。4天后進行重復治療，觀察各組小鼠腫瘤的

4、生長情況。兩次治療1周后脫頸椎處死實驗動物，無菌取腫瘤組織和脾臟進行后續(xù)實驗。 后續(xù)實驗包括： (1)測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。 (2)腫瘤標本HE染色和三種纖維(網狀纖維、彈力纖維、膠原纖維)特殊染色標記。 (3)腫瘤組織內免疫組織化學檢測：CD4，CD8，ICAM-1。 (4)流式細胞術檢測脾臟T淋巴細胞數(shù)量。 研究結果： (1)瘤內緩釋治療對小鼠腫瘤生長的影響瘤內緩釋治

5、療的抑瘤實驗結果表明兩組緩釋治療均對腫瘤的增長有明顯的抑制作用，提示緩釋治療可以抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。同時在緩釋治療的兩組中，免疫緩釋治療組與單純緩釋治療組相比，前者對腫瘤生長的抑制更加有效。由腫瘤生長曲線可看出各組的腫瘤生長曲線斜率都有明顯的差別。隨時間進展，生理鹽水對照組腫瘤體積增長速度明顯高于其他組別，而免疫緩釋治療組，腫瘤體積增長在第二次治療后出現(xiàn)平臺期，腫瘤增殖相對停滯。 (2)瘤內緩釋治療后腫瘤組織的病理改變切片

6、鏡下可見，對照組瘤細胞排列密集成片，壞死區(qū)較少，瘤體內血管豐富，腫瘤組織生長旺盛。單純緩釋組及免疫緩釋組的瘤細胞區(qū)域則出現(xiàn)大片壞死，瘤細胞溶解以及細胞核固縮，散在區(qū)域性存活腫瘤細胞灶，切片染色較對照組淺。 腫瘤壞死情況：觀察腫瘤壞死范圍，并根據(jù)不同壞死程度所占比例計算壞死率，其壞死程度不一；生理鹽水對照組壞死較少；Ara-C組以輕、中度壞死為主，部分見到小片狀瘤細胞變性；緩釋兩組以中重度壞死為主，見到大小不一的多個凝固性壞死灶。

7、 (3)瘤內緩釋治療后腫瘤組織的三種纖維特殊染色切片特殊染色顯示與兩對照組相比，兩治療組的腫瘤組織中彈性纖維明顯較粗，連續(xù)分布于腫瘤組織內及瘤旁組織，著色深；膠原纖維明顯增多，排列紊亂，出現(xiàn)分支且互相交織，呈連續(xù)分布，著色深；瘤組織中網狀纖維明顯增多、增粗，有大的分支并交織成網狀，著色深。定量分析顯示與兩對照組相比，單純緩釋治療組和免疫緩釋治療組中三種纖維含量均明顯升高(P<0.01)。 (4)瘤內緩釋治療后腫瘤組織的I

8、CAM-1免疫組化染色染色陽性信號為棕黃色顆粒，主要是細胞膜表達。染色結果顯示兩緩釋治療組的腫瘤組織中ICAM-1陽性表達量明顯較兩對照組增多(P<0.01)。在兩治療組中，免疫緩釋組較單純緩釋組的ICAM-1陽性表達量同樣也有明顯的增多(P<0.05)。 (5)瘤內緩釋治療后腫瘤組織的CD4，CD8免疫組化染色染色陽性信號為棕黃色顆粒，主要是細胞膜表達。染色結果顯示兩治療組的腫瘤組織中CD4，CD8陽性表達量明顯較兩對照組增多

9、。 (6)流式細胞術分析脾內T細胞數(shù)量FCM檢測結果顯示，與NS對照組和Ara-C對照組相比，兩治療組脾臟中CD4<'+>及CD8<'+>T淋巴細胞標記率均明顯增高(P<0.01)。但各實驗組CD4<'+>/CD8<'+>的比值之間未有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這個結果表明緩釋治療可在一定程度上改善細胞免疫功能。 結論： 1．瘤內緩釋治療可以明顯抑制小鼠腫瘤生長，導致腫瘤細胞大片壞死。 2．瘤內緩釋治療