瘤內(nèi)緩釋治療對(duì)小鼠腫瘤抑制作用的機(jī)制探討.pdf

1、研究目的： 理想的腫瘤治療方法是使抗腫瘤藥以一定的濃度和時(shí)間在腫瘤組織內(nèi)充分發(fā)揮作用，同時(shí)減少藥物的毒副作用。常規(guī)的全身性系統(tǒng)化療往往無(wú)法在腫瘤組織中達(dá)到有效的藥物濃度，而加大藥物劑量勢(shì)必會(huì)增加了一定的毒副作用，從而使機(jī)體不能耐受。因此為增強(qiáng)抗腫瘤藥的作用，已有許多研究通過(guò)將抗腫瘤藥注入實(shí)體腫瘤內(nèi)，使腫瘤組織長(zhǎng)時(shí)間與高濃度的抗腫瘤藥接觸，從而提高了治療腫瘤的療效。在此基礎(chǔ)上，我們利用腫瘤組織作為藥物載體形成藥物緩釋庫(kù)，將有效的化

2、療藥物結(jié)合緩釋液及半抗原二硝基苯(DNP)進(jìn)行腫瘤內(nèi)的緩釋治療，通過(guò)提高藥物在腫瘤部位的作用，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力以及刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，從而達(dá)到更加有效的治療腫瘤的目的。 研究方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，雌雄各半，周齡6～8周，體重18～22g，無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)。B16黑色素瘤細(xì)胞用RPMI1640(含10﹪FCS)培養(yǎng)，37℃，5﹪CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，約2～4天傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16黑色素瘤細(xì)胞造模

3、，此時(shí)細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳。將制備好的濃度為2×10<'6>個(gè)/ml瘤液取0.2 ml于無(wú)菌條件下皮下注射接種于小鼠左前肢腋下，一般在接種后5～6天時(shí)腫瘤生長(zhǎng)至符合實(shí)驗(yàn)要求，隨機(jī)分組進(jìn)行初次治療，0.2ml/只，依次為①生理鹽水對(duì)照組，瘤內(nèi)注射N(xiāo)S；②Ara-c對(duì)照組，瘤內(nèi)注射Ara-c；③單純緩釋治療組，瘤內(nèi)注射Ara-C+緩釋液；④免疫緩釋治療組，瘤內(nèi)注射Ara-c+緩釋液+DNP。4天后進(jìn)行重復(fù)治療，觀察各組小鼠腫瘤的

4、生長(zhǎng)情況。兩次治療1周后脫頸椎處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，無(wú)菌取腫瘤組織和脾臟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)包括： (1)測(cè)量腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。 (2)腫瘤標(biāo)本HE染色和三種纖維(網(wǎng)狀纖維、彈力纖維、膠原纖維)特殊染色標(biāo)記。 (3)腫瘤組織內(nèi)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：CD4，CD8，ICAM-1。 (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量。 研究結(jié)果： (1)瘤內(nèi)緩釋治療對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響瘤內(nèi)緩釋治

5、療的抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩組緩釋治療均對(duì)腫瘤的增長(zhǎng)有明顯的抑制作用，提示緩釋治療可以抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)在緩釋治療的兩組中，免疫緩釋治療組與單純緩釋治療組相比，前者對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制更加有效。由腫瘤生長(zhǎng)曲線可看出各組的腫瘤生長(zhǎng)曲線斜率都有明顯的差別。隨時(shí)間進(jìn)展，生理鹽水對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯高于其他組別，而免疫緩釋治療組，腫瘤體積增長(zhǎng)在第二次治療后出現(xiàn)平臺(tái)期，腫瘤增殖相對(duì)停滯。 (2)瘤內(nèi)緩釋治療后腫瘤組織的病理改變切片

6、鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組瘤細(xì)胞排列密集成片，壞死區(qū)較少，瘤體內(nèi)血管豐富，腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛。單純緩釋組及免疫緩釋組的瘤細(xì)胞區(qū)域則出現(xiàn)大片壞死，瘤細(xì)胞溶解以及細(xì)胞核固縮，散在區(qū)域性存活腫瘤細(xì)胞灶，切片染色較對(duì)照組淺。 腫瘤壞死情況：觀察腫瘤壞死范圍，并根據(jù)不同壞死程度所占比例計(jì)算壞死率，其壞死程度不一；生理鹽水對(duì)照組壞死較少；Ara-C組以輕、中度壞死為主，部分見(jiàn)到小片狀瘤細(xì)胞變性；緩釋兩組以中重度壞死為主，見(jiàn)到大小不一的多個(gè)凝固性壞死灶。

7、 (3)瘤內(nèi)緩釋治療后腫瘤組織的三種纖維特殊染色切片特殊染色顯示與兩對(duì)照組相比，兩治療組的腫瘤組織中彈性纖維明顯較粗，連續(xù)分布于腫瘤組織內(nèi)及瘤旁組織，著色深；膠原纖維明顯增多，排列紊亂，出現(xiàn)分支且互相交織，呈連續(xù)分布，著色深；瘤組織中網(wǎng)狀纖維明顯增多、增粗，有大的分支并交織成網(wǎng)狀，著色深。定量分析顯示與兩對(duì)照組相比，單純緩釋治療組和免疫緩釋治療組中三種纖維含量均明顯升高(P<0.01)。 (4)瘤內(nèi)緩釋治療后腫瘤組織的I

8、CAM-1免疫組化染色染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要是細(xì)胞膜表達(dá)。染色結(jié)果顯示兩緩釋治療組的腫瘤組織中ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)量明顯較兩對(duì)照組增多(P<0.01)。在兩治療組中，免疫緩釋組較單純緩釋組的ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)量同樣也有明顯的增多(P<0.05)。 (5)瘤內(nèi)緩釋治療后腫瘤組織的CD4，CD8免疫組化染色染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要是細(xì)胞膜表達(dá)。染色結(jié)果顯示兩治療組的腫瘤組織中CD4，CD8陽(yáng)性表達(dá)量明顯較兩對(duì)照組增多

9、。 (6)流式細(xì)胞術(shù)分析脾內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與NS對(duì)照組和Ara-C對(duì)照組相比，兩治療組脾臟中CD4<'+>及CD8<'+>T淋巴細(xì)胞標(biāo)記率均明顯增高(P<0.01)。但各實(shí)驗(yàn)組CD4<'+>/CD8<'+>的比值之間未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這個(gè)結(jié)果表明緩釋治療可在一定程度上改善細(xì)胞免疫功能。 結(jié)論： 1．瘤內(nèi)緩釋治療可以明顯抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大片壞死。 2．瘤內(nèi)緩釋治療