北豆根總堿對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究北豆根總堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela凋亡、細(xì)胞周期及侵襲性的影響，探討北豆根總堿抗腫瘤作用機(jī)制，為抗腫瘤新藥的研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)不同濃度北豆根總堿（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/ml）處理不同時(shí)間（24、48和72小時(shí)）對(duì)Hela細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用。
　　 2.采用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)

2、不同濃度北豆根總堿（0、4、16、40μg/ml）作用48小時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及周期變化的影響。
　　 3.瑞氏-姬姆薩染色后顯微鏡觀察北豆根總堿（0、40μg/ml）作用24小時(shí)后Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.采用Transwell小室法檢測(cè)北豆根總堿（0、40pg/ml）作用24小時(shí)后對(duì)Hela細(xì)胞侵襲性的影響。
　　 5.采用免疫印跡（Western blot）方法檢測(cè)不同濃度北豆根總堿（0、4、

3、16、40μg/ml）作用24小時(shí)后，Hela細(xì)胞中磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、C-myc、CyclinDl的表達(dá)變化。
　　 6.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（revers transcription PCR，RT-PCR）半定量檢測(cè)北豆根總堿（0、4、16、40μg/ml）作用24小時(shí)，Hela細(xì)胞抗凋亡基因bcl-2、促凋亡基因bax、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)變化。
　　 7.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡

4、（laser scanning microscope，LSM）觀察北豆根總堿（0、40μg/ml）作用24小時(shí)后，Hela細(xì)胞內(nèi)P-ERK.、ERK、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.北豆根總堿對(duì)Hela細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，隨著北豆根總堿濃度及作用時(shí)間的增加，對(duì)細(xì)胞的抑制率升高。其中50μg/ml北豆根總堿作用72小時(shí)對(duì)細(xì)胞抑制率最高（85.37％）；與對(duì)照組相比，不同濃度北豆根總堿對(duì)細(xì)胞

5、增殖的抑制率均有顯著性差異（p<0.05）。
　　 2.北豆根總堿能明顯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯。隨著北豆根總堿作用濃度的增大，細(xì)胞的凋亡率升高，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少，對(duì)照組與試驗(yàn)組之間比較有顯著性差異（p<0.05）。
　　 3.北豆根總堿作用24小時(shí)后，Hela細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)凋亡前期改變。
　　 4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)北豆根總堿（0，40μg/ml）作

6、用24小時(shí)后，穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著減少，存在顯著差異（p<0.05）。
　　 5.Western blot分析結(jié)果顯示，經(jīng)4、16、40μg/ml北豆根總堿處理24小時(shí)后，Hela細(xì)胞中磷酸化ERK、C-myc、CyclinD1表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞比較均有所下降，ERK表達(dá)無顯著性變化。
　　 6.半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度北豆根總堿處理后，Hela細(xì)胞抗凋亡基因bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9MMP-9

7、 tuRNA表達(dá)水平逐漸降低，促凋亡基因bax mRNA表達(dá)水平逐漸增高，與對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.05），該現(xiàn)象隨著濃度北豆根總堿濃度的升高而更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。
　　 7.LSM熒光圖像分析結(jié)果顯示，北豆根總堿（40μg/ml）作用24小時(shí)后，Hela細(xì)胞內(nèi)抗Bax蛋白抗染色的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增加，抗P-ERK、Bal-2抗體熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯降低，ERK抗體熒光強(qiáng)度較對(duì)照組無明顯變化。
　　

8、 結(jié)論：
　　 1.北豆根總堿在一定濃度范圍內(nèi)，能抑制宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖，具有明顯的量效關(guān)系。
　　 2.北豆根總堿可通過降低Hela細(xì)胞中磷酸化ERK（P-ERK）水平，抑制Hela細(xì)胞ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 3.北豆根總堿通過抑制Hela細(xì)胞ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減弱bcl-2，MMP-9 mRNA表達(dá)，增強(qiáng)bax mRNA表達(dá)，減弱Hela細(xì)胞中C-myc、Cyclin D1蛋白的表達(dá)，