腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體誘導喉鱗狀細胞癌凋亡的實驗研究.pdf

1、本文為了進一步研究其對喉鱗狀細胞癌的作用機制，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法以及免疫組織化學方法，檢測了68例LSCC和30例正常喉黏膜中TRAIL及其死亡受體DR4、DR5，誘騙受體DcR1、DcR2的表達及分布情況；其后，應(yīng)用不同濃度TRAIL作用于體外培養(yǎng)的喉鱗癌Hep-2細胞，通過倒置顯微鏡及透射電鏡觀察細胞的微觀形態(tài)學改

2、變，應(yīng)用噻唑藍染色(MTT)、流式細胞儀、原位末端標記(TUNEL)等方法，分析TRAIL對Hep-2-N胞凋亡誘導作用的機制；并且建立人喉鱗癌裸鼠動物模型，應(yīng)用TRAIL進行治療，觀察其在動物體內(nèi)抑瘤效果，應(yīng)用蘇木精-伊紅(H-E)染色及透射電鏡進行腫瘤微觀形態(tài)學觀察，研究TRAIL抑制喉鱗癌的機制。 研究材料和方法： 1、選取中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科及哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉．頭頸外科2005年3

3、-6月期間手術(shù)切除的68例喉鱗癌標本，應(yīng)用RT．PcR及免疫組化方法檢測TRAIL及其受體DR4、DR5、DcR1、DcR2的表達情況，取同期手術(shù)切除的30例正常喉粘膜作為對照。 2、分別將不同濃度的TRAIL加入到體外培養(yǎng)的喉鱗癌Hep-2細胞中，應(yīng)用倒置顯微鏡，透射電鏡觀察經(jīng)TRAIL作用后細胞的微觀形態(tài)學改變，應(yīng)用MTlT法繪制細胞的生長曲線，觀察細胞生長抑制率。應(yīng)用流式細胞儀及TUNEL檢測細胞凋亡發(fā)生率。 3、

4、應(yīng)用Hep-2細胞株建立人喉鱗癌裸鼠動物模型并應(yīng)用TRAIL進行治療，觀察腫瘤的生長情況，裸鼠的生存狀態(tài)，以及死亡發(fā)生的情況。并分別在光學顯微鏡，透射電鏡下對兩組的腫瘤組織進行微觀形態(tài)學觀察。 研究結(jié)果： 1、經(jīng)RT-PcR及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，在LSCC及正常喉黏膜組織中普遍存在著TRAIL及其受體的表達，并且存在著表達類型的差異。其中，TRAIL及誘騙受體DcR1、DcR2在LSCC中表達較低，而在正常喉黏膜中則表達較

5、高，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。死亡受體DR4、DR5在LSCC及正常喉黏膜中的表達無明顯差異(P均>0.05)。 2、RT-PCR．結(jié)果顯示，在早期喉癌(Ⅰ+Ⅱ期)，其表達TRAIL及誘騙受體DcR較高，而晚期喉癌(Ⅲ+Ⅳ)中則表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，死亡受體。DR在兩組間無明顯差異(P均>0.05)；TRAIL及DcR在分化程度高的腫瘤組中表達也高，在分化程度中、低組的腫瘤表達低，差異具有統(tǒng)

6、計學意義(P均<0.01)，死亡受體DR在兩組間無明顯差異(P均>0.05)。 3、免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在早期喉癌(Ⅰ+Ⅱ期)，其表達TRAIL及誘騙受體DcR較高，而在晚期喉癌(Ⅲ+Ⅳ)中則表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(TRAILP<0.05，DcR P<0.01)，死亡受體DR在兩組間無明顯差異(P均>0.05)；TRAIL及DcR在分化程度高的腫瘤組中表達高，在分化程度中、低組的腫瘤表達低，差異具有統(tǒng)計學意義(TRAILP<

7、0.05，DcR1 P<0.01，DcR2P<0.05)，死亡受體DR在兩組間無明顯差異(P均>0.05)。 4、通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TRAIL對Hep-12細胞的作用與藥物的劑量存在著明顯相關(guān)系，TRAIL的濃度越高，其對細胞生長的抑制作用也越顯著。 5、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TRAIL處理后的Hep-2細胞中可見細胞發(fā)生凋亡，細胞內(nèi)出現(xiàn)核碎裂，核仁消失，染色質(zhì)固縮，電子密度增高，線粒體腫脹，嵴不清，并觀察到有凋亡小體形

8、成。 6、MTT證實不同濃度的TRAIL作用于體外培養(yǎng)的喉癌Hep-2細胞24小時，其細胞生長抑制率隨著濃度的增加逐漸增大，而流式細胞儀分析，當TRAlL濃度為(1，10，100ng/ml)時，誘導凋亡率分別為11.49±0.36％，22.31±0.82％，59.64±1.10％，與對照組(TRAIL濃度0 ng/ml)凋亡率3.13±0.12％之間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。 7、TUNEL檢測經(jīng)TR

9、AIL作用后的所有標本都能觀察到細胞核染成棕黃色的凋亡細胞。喉鱗癌Hep-2細胞經(jīng)TRAIL(1，10，100ng/ml)處理后凋亡率分別為16.66±0.80％，42.01±2.58％，68.93±212％，與對照組(TRAIL濃度0ng/ml)凋亡率為3.32±0.19％之間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0．01)。 8、喉鱗癌裸鼠動物模型均建立成功。實驗發(fā)現(xiàn)，注射TRAⅡ_，(100ng／m1)治療的實驗組裸鼠狀態(tài)良好，

10、無明顯消瘦，瘤體生長緩慢、停滯，而應(yīng)用PBS的對照組腫瘤持續(xù)增長，體積明顯增大，呈多中心生長，裸鼠狀態(tài)差，漸消瘦，呈現(xiàn)惡液質(zhì)狀態(tài)，甚至死亡；觀察期間內(nèi)，對照組裸鼠死亡8只，死亡率為40％，而應(yīng)用TRAIL的實驗組，裸鼠僅死亡1只，死亡率為5％。治療后兩組裸鼠腫瘤體積、腫瘤重量相比較，實驗組腫瘤明顯小于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，抑瘤率為53.8％。 9、H-E染色光鏡觀察可見，對照組腫瘤細胞生長旺盛，細胞分裂相

11、多見，萎縮壞死區(qū)較少：而TRAIL治療組腫瘤生長受抑制，分裂不明顯，出現(xiàn)多處萎縮壞死灶。 10、電鏡觀察實驗組腫瘤細胞生長受到抑制，核內(nèi)染色質(zhì)電子密度增高，胞質(zhì)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)減少，線粒體電子密度增大，嵴不清，核固縮，有凋亡小體形成。而對照組腫瘤細胞生長分裂旺盛，細胞間連接呈融合狀態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴清晰，游離核蛋白體豐富，核膜結(jié)構(gòu)完好。 研究結(jié)論： 1、在LSCC及正常喉黏膜組織中，均存在TRAIL及其四個受體的表達，T

12、RAIL及誘騙受體DcR在LscC組織中與在正常喉黏膜中表達存在差異，這種分布特征是TRAIL對不同細胞表現(xiàn)出的選擇性殺傷作用的基礎(chǔ)。 2、在LSCC組織中，TRAIL與死亡受體結(jié)合而發(fā)揮作用，誘導喉鱗癌腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而在正常喉黏膜組織中誘騙受體可以競爭死亡受體與TRAIL結(jié)合從而抑制凋亡。 3、TRAIL及誘騙受體DcR的表達分布與LSCC的病理分期以及分化程度均存在明顯的相關(guān)性。 4、人喉鱗癌Hep-2細