CTGF和TGF-β1對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌病變的影響及洛汀新的干預(yù)作用.pdf

1、目的：心血管病變是糖尿病患者的主要死亡原因，約80％的糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。糖尿病心肌病(diabetic cardiomvopamy，DCM)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是糖尿病的一個(gè)獨(dú)立并發(fā)癥。其特征性的病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞外基質(zhì)(ECM)集聚和心肌間質(zhì)重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌肥厚和心肌纖維化。臨床特征早期以心臟舒張功能不全、晚期以心臟收縮功能障礙為主。多種研究發(fā)現(xiàn)高血糖導(dǎo)致的代謝紊亂是DCM的始動(dòng)因素，細(xì)胞功能改變、多種細(xì)胞因子

2、和蛋白、酶等都參與了DCM的發(fā)生發(fā)展。由于其病因復(fù)雜，病理生理改變獨(dú)特，癥狀不顯著，且缺乏特異的診斷標(biāo)準(zhǔn)，故臨床研究及早期干預(yù)治療有一定困難。 本研究目的旨在： 1 建立大鼠2型糖尿病心肌病模型；2 探討DCM動(dòng)物模型心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化；3 明確一種新發(fā)現(xiàn)的促纖維化生長(zhǎng)因子-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在糖尿病心肌病發(fā)病中的作用，及其與血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-βl)的關(guān)系，進(jìn)一步闡明DCM的發(fā)病機(jī)制，

3、尋找和發(fā)現(xiàn)有效防治糖尿病心肌病的新方法。 方法： 1．大鼠2型糖尿病心肌病模型的制備選用清潔級(jí)、健康雄性8周齡Wistar大鼠45只，體重199±14g。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為兩組，正常對(duì)照組15只和實(shí)驗(yàn)組30只，按高脂飲食+小劑量STZ(streptozotocin)制造2型糖尿病模型，成模后繼續(xù)喂養(yǎng)8周使發(fā)生糖尿病心肌病變。正常對(duì)照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組給予高脂高熱量飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，測(cè)兩組大鼠空腹血糖(

4、FBG)、空腹胰島素(FINS)、血清甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)，以李氏自我平衡模型分析法(homeostasis model assessment，HOMA)指數(shù)作為評(píng)價(jià)胰島素抵抗指標(biāo)。出現(xiàn)胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)組大鼠再給予小劑量STZ 30mg/kg(STZ溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.2)腹腔注射，正常對(duì)照組給予相同劑量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。2周后實(shí)驗(yàn)組大鼠行葡萄糖糖耐量(OGTT)試驗(yàn)，以空腹血糖≥7.8m

5、m0l/L和(或)餐后2小時(shí)血糖≥11.1 mmol/L作為糖尿病模型組。成模型的實(shí)驗(yàn)組大鼠再隨機(jī)分為兩組：糖尿病心肌病組和洛汀新干預(yù)組。繼續(xù)原飲食方案喂養(yǎng)8周。 2．血糖、胰島素、血脂測(cè)定大鼠禁食水12小時(shí)后空腹內(nèi)眥靜脈取血，分離出血清用葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖，放射免疫法測(cè)胰島素。采用穩(wěn)態(tài)模型(Homeoestasis Model Assessment, HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity In

6、dex，ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗程度。比色法測(cè)定甘油三酯(triglycerid，TG)、總膽固醇(totalch01ester01e，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity1ipoprotein-ch01esterole，HDL-C)。低密度脂蛋白膽固醇 (lowerdensity lipoprotein-ch01esterole，LDL-C) 由Friedewald式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出(以mol

7、/L計(jì))。Cu<'+>比色法測(cè)定游離脂肪酸(FFAs)含量。 3．免疫組織化學(xué)染色比較CTGF和TGF-βl在三組大鼠心肌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組大鼠再隨機(jī)分成2組：糖尿病心肌病組和洛汀新干預(yù)組。洛汀新干預(yù)組大鼠給予洛汀新10mg/kg/d灌胃，正常對(duì)照組和糖尿病心肌病組給予相同劑量蒸餾水灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后處死大鼠取心肌組織經(jīng)4％多聚甲醛固定、石蠟包埋，用于形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化(電鏡標(biāo)本用4％戊二醛固定，樹脂包埋)。應(yīng)用免疫組化觀察比

8、較正常對(duì)照組大鼠、洛汀新干預(yù)組大鼠與糖尿病心肌病組大鼠心肌中CTGF和TGF-β1表達(dá)差異。 4．心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查常規(guī)方法制備大鼠心肌光鏡及電鏡組織切片，行HE、vG染色觀察比較大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)和心肌間質(zhì)膠原的變化，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)的

9、顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果： 1．大鼠體重的變化實(shí)驗(yàn)初，大鼠隨機(jī)分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，具有可比性。8周后，即STZ注射前，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重明顯升高(P<0.01)。 注射STz后，糖尿病心肌病組及洛汀新干預(yù)組大鼠體重增長(zhǎng)減慢。試驗(yàn)?zāi)悄虿⌒募〔〗M與洛汀新干預(yù)組大鼠體重?zé)o顯著差別(p>0.05)，但與正常對(duì)照組相比，兩組大鼠體重仍明顯增

10、高(p<0.05)。 2．各組大鼠生化指標(biāo)比較實(shí)驗(yàn)8周末，實(shí)驗(yàn)組大鼠與正常對(duì)照組相比空腹血糖無顯著差別，但胰島素水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，胰島素敏感指數(shù)明顯下降，出現(xiàn)胰島素抵抗；血清TC、TG、LDL及FFA均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。 試驗(yàn)?zāi)?，與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病心肌病組和洛汀新干預(yù)組大鼠空腹血糖顯著升高(P<0.01)，空腹胰島素?zé)o顯著差異(p>0.05)；胰島素敏感指數(shù)仍明顯下

11、降(P<0.01)；血脂水平仍明顯升高(P<0.01)。 3．心肌細(xì)胞形態(tài)及膠原實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與正常對(duì)照組相比，糖尿病心肌病組大鼠心肌細(xì)胞稀疏、腫大；心肌間質(zhì)膠原明顯增多；心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著病變。洛汀新干預(yù)組心肌細(xì)胞形態(tài)、膠原量及超微結(jié)構(gòu)均明顯好轉(zhuǎn)，但仍較正常對(duì)照組仍差。 4．各組大鼠心肌CTGF、TGF-βl表達(dá)水平CTGF主要存在于心肌間質(zhì)，TGF-βl主要存在于心肌細(xì)胞胞漿，免疫組化染成棕黃色。 CTGF

12、：正常對(duì)照組大鼠心肌間質(zhì)細(xì)胞及血管周圍CTGF呈弱陽性表達(dá)；糖尿病心肌病組大鼠心肌間質(zhì)細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)；洛汀新干預(yù)組心肌間質(zhì)CTGF明顯減少，但仍較正常對(duì)照組表達(dá)多。 TGF-βl：正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞漿有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變。糖尿病心肌病組大鼠心肌細(xì)胞胞漿中及細(xì)胞周圍、血管周圍出現(xiàn)多的棕黃色顆粒物質(zhì)，成強(qiáng)陽性反應(yīng)。 洛汀新干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞胞漿中和胞周、血管周圍棕黃色顆粒物質(zhì)較糖尿病心肌病組大鼠

13、明顯減少，但是較正常對(duì)照組仍有增多。 結(jié)論： 1 大鼠2型糖尿病模型制備采用高脂飲食使大鼠肥胖產(chǎn)生高血脂及胰島素抵抗，然后給予小劑量STZ腹腔注射部分破壞胰島B細(xì)胞使胰島素逐漸減少最終發(fā)生糖尿病。其發(fā)病過程及特征符合人類2型糖尿病臨床過程及代謝特征，具有中度高血糖、高血脂及胰島素抵抗。并且持續(xù)的高血糖成為糖尿病心肌病變發(fā)生的內(nèi)環(huán)境因素。 2 試驗(yàn)?zāi)?，糖尿病心肌病組大鼠心臟重量增加，心肌肥厚，心肌細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)