SOCS在原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種慢性炎癥性、進(jìn)行性肘內(nèi)膽汁淤積性自身免疫性肝病，以血清中出現(xiàn)抗線粒體抗體(antimitochondrialantibody，AMA)和導(dǎo)致膽汁淤積性肝硬變的肝臟門(mén)脈周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)、小膽管特異性破壞為特征，最終發(fā)展成肝硬化和肝衰竭。PBC的病因和確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，可能與遺傳因素、病毒和細(xì)菌感染、自身免疫狀態(tài)及環(huán)境因素等有關(guān)。可能的發(fā)病機(jī)理

2、是：機(jī)體對(duì)自身抗原的耐受性被打破，致使肝內(nèi)中、小膽管上皮細(xì)胞不斷受到免疫系統(tǒng)的攻擊而引起膽汁淤積最終發(fā)病。但是，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答的始動(dòng)兇素和自身免疫耐受破壞的機(jī)制尚不清楚。 在過(guò)去的十幾年里，對(duì)PBC的細(xì)胞免疫研究主要在外周血不同T細(xì)胞亞群，如Th1、Th17和CTL的研究。而對(duì)免疫耐受起關(guān)鍵作用的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的功能研究非常少，可能是受到DC標(biāo)本來(lái)源以及培養(yǎng)技術(shù)的限制。DC是目前所知的機(jī)體內(nèi)功

3、能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它不僅是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，而且在誘導(dǎo)免疫耐受、調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。 JAK-STAT途徑是一條多種細(xì)胞因子共用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在很多慢炎癥性疾病特別是有自身免疫因素參與的疾病中發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的，在JAK-STAT信號(hào)和Toll樣受體(toll like

4、 receptor，TLR)通路中重要的負(fù)調(diào)控蛋白，可以避免機(jī)體的過(guò)度免疫反應(yīng)。 SOCS可以負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的激活，并參與T細(xì)胞的分化和免疫調(diào)控等活動(dòng)，是機(jī)體免疫調(diào)控系統(tǒng)的重要組成成份。SOCS1是DC介導(dǎo)的T細(xì)胞激活和保持免疫耐受的必須的負(fù)調(diào)控蛋白。目前通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)SOCS可以治療許多有細(xì)胞因子信號(hào)通路參與的感染性和免疫性疾病，推測(cè)SOCS對(duì)自身免疫性疾病的治療具有一定的作用。 迄今為止，JAK-

5、STAT-SOCS通路在PBC發(fā)病過(guò)程中的作用缺乏研究，細(xì)胞因予的變化與SOCS的負(fù)調(diào)控作用是否有關(guān)?PBC病人中DC的功能研究也非常少，那么PBC免疫耐受的破壞是否與SOCS介導(dǎo)的DC功能變化有關(guān)? 基于以上國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和存在問(wèn)題，本課題擬通過(guò)測(cè)定PBC病人血清中炎性細(xì)胞兇子的變化，外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)SOCS的變化，并利用PBMCs誘導(dǎo)和培養(yǎng)

6、樹(shù)突狀細(xì)胞，觀察SOCS對(duì)DC功能的影響，來(lái)進(jìn)一步研究SOCS在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為PBC的免疫學(xué)治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。 第一部分原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清學(xué)中炎性細(xì)胞因子的變化 機(jī)體免疫系統(tǒng)的自身調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)依賴(lài)于促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡，當(dāng)這種平衡被打破，就會(huì)引起自身免疫現(xiàn)象，檢測(cè)細(xì)胞因子的變化可以反映機(jī)體的炎性狀態(tài)和免疫狀態(tài)。研究對(duì)象為78例PBC病人，30例慢性乙肝病人(chronic hepati

7、tis Bvirus，CHB)和60例健康對(duì)照者(healthy control，HC)。ELISA檢測(cè)促炎細(xì)胞因子[IL-6，IL-17，Interferon-gamma(IFN-γ)]和抗炎細(xì)胞因子(IL-10，TGF-β)，免疫比濁法檢測(cè)CRP的變化。 第二部分 PBC患者外周血中TLR和SOCS的表達(dá) TLRs通路活化可以誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，不僅能誘導(dǎo)自身免疫，而且能調(diào)節(jié)免疫耐受。SOCS1和SOCS3

8、是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和ITLR通路中最重要的兩個(gè)因子。小部分主要檢測(cè)外周血中TLR和SOCS的mRNA水平以及SOCS的蛋白水平，來(lái)研究SOCS在PBC外周血中的變化。 1、PBC患者PBMCs中TLR和SOCS mRNA水平的表達(dá) 外周血分離PBMCs，抽提細(xì)胞總RNA，建立RT-PCR方法，測(cè)定了32例PBC，30例CHB和32例HC組PBMCs的TLR4、TLR9、SOCS1、SOCS3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，P

9、BC病人的TLR4、TLR9、SOCS1和SOCS3 mRNA的水平均顯著性高于HC，為HC組的1.48、2.51、3.43和1.48倍(P＜0.05)，TLR9和SOCS1的mRNA水平是CHB的6.85倍和2.99倍(P＜0.05)。 2、PBC患者PBMCs中SOCS在蛋白水平的表達(dá) 利用Western-blot方法檢測(cè)PBC患者和健康對(duì)照者PBMCs中SOCS1和SOCS3在蛋白水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示，SOCS1

10、和SOCS3在PBC患者PBMCs中表達(dá)明顯高于健康塒照者。 上述發(fā)現(xiàn)證實(shí)了TLR-SOCS通路在自身免疫性疾病中的作用，本實(shí)驗(yàn)中TLR4和TLR9在PBC病人中的顯著升高說(shuō)明TLR過(guò)度激活，這與PBC的發(fā)生可能有一定關(guān)系，而SOCS作為多條信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子，雖然表達(dá)也升高，但不能完全抑制細(xì)胞因子和HTLR通路的過(guò)度激活作用，推測(cè)SOCS在PBC發(fā)病過(guò)程中的負(fù)反饋效應(yīng)發(fā)揮的不夠。 第三部分 PBC患者外周血來(lái)源的D

11、C中SOCS的表達(dá)及其作用 我們前兩部分的研究表明PBC病人處于慢性炎性狀態(tài)，SOCS在外周血中表達(dá)升高，并不能完全抑制細(xì)胞因子和TLR通路的過(guò)度激活作用。既然SOCS在DC中高表達(dá)，那么SOCS是否會(huì)引起PBC病人的DC的功能變化從而誘導(dǎo)免疫耐受的變化?基于這些疑問(wèn)，我們通過(guò)10例PBC的病人，8例HC，PBMCs誘導(dǎo)和培養(yǎng)DC，觀察SOCS在PBC病人DC中的變化，以及DC的表型和分泌細(xì)胞因子的變化，來(lái)闡述SOCS在PBC發(fā)

12、病機(jī)制中的作用。 1、流式細(xì)胞術(shù)(flow eytometry，F(xiàn)CM)分析DC表型 用FCM分析PBC病人DC的細(xì)胞表型，結(jié)果顯示CD83，CD86和HLA-DR的表達(dá)率分別為：(79.4±4.8)％，(86.5±6.3)％和(90±3.5)％，與HC組的表達(dá)率[(68.3±4.1)％，(74.2±6.3)％和(83.6±7.6)％]相比，三者均顯著性升高(P＜0.05)。 2、ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞

13、因子含量的變化 PBC病人的DC分泌的細(xì)胞因子IL-10，IL-12和IFN-γ分別為：(7.0±4.6)pg/ml，(53.5±11.1)pg/ml和(32.0±9.0)pg/ml，與HC組[(5.8±4.2)pg/ml，(32.1±10.7)pg/ml和(15.4±8.1)pg/ml)]相比，IL-12和IFN-γ顯著性升高(P＜0.05)，而IL-10在兩組之間無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。 3、Western

14、blot測(cè)定DC中SOCS1和SOCS3的變化 本部分研究說(shuō)明PBC患者體內(nèi)DC可能更傾向于成熟狀態(tài)，通過(guò)DC表面CD86等協(xié)同刺激分子的差異表達(dá)，使抗原遞呈能力明顯增強(qiáng)，IL-12和IFN-γ的分泌增加更容易誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的活化，使機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)度，導(dǎo)致了機(jī)體內(nèi)免疫平衡的紊亂和免疫耐受的破壞，從而誘發(fā)了自身免疫性疾病。 第四部分線粒體M2蛋白通過(guò)SOCS1通路對(duì)DC的作用 PBC的主要免疫學(xué)指標(biāo)是AMA

15、陽(yáng)性，其血清陽(yáng)性率可達(dá)90％以上，而抗M2亞型抗體是PBC的特異性抗體。我們?cè)诘谌糠职l(fā)現(xiàn)PBC外周血來(lái)源的DC中SOCS的表達(dá)降低，與外周血的升高不一致，那么SOCS在PBC發(fā)病過(guò)程中通過(guò)何種途徑發(fā)揮作用?以及線粒體M2蛋白是否會(huì)通過(guò)活化JAK-STAT-SOCS途徑，并激活DC，從而參與T細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的分泌?為回答這些疑問(wèn)，我們?cè)隗w外誘導(dǎo)和培養(yǎng)健康獻(xiàn)血者外周血全白細(xì)胞來(lái)源的DC，利用SOCS1的RNA干擾實(shí)驗(yàn)，并在M2蛋白刺

16、激下，模擬PBC的發(fā)病情況，探討SOCS1對(duì)DC功能的影響。 1、SOCS1 SiRNA的轉(zhuǎn)染和抑制效率 利用熒光染料FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照可以判斷SiRNA轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染6h后，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，SiRNA的轉(zhuǎn)染效率很高，可以達(dá)到95％左右，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。用RT-PCR檢測(cè)其抑制效率，發(fā)現(xiàn)SOCS1-156抑制效率最高，在mRNA水平以抑制85％。 2、FCM測(cè)定DC表面CD83和CD86的表達(dá)

17、 3、ELISA測(cè)定DC培養(yǎng)上清IL-12和IL-10的變化 4、western blot檢測(cè)DC中SoCS和STAT的變化 本研究我們從負(fù)調(diào)控的角度首次研究了SOCS在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用，初步認(rèn)為SOCS在外周血的表達(dá)升高是由細(xì)胞因子和TLR激活引起的被動(dòng)性升高，但其升高并不能完全抑制機(jī)體的過(guò)度免疫反應(yīng)；而在DC中的低表達(dá)與DC的成熟，抗原遞呈和誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的極化能力增強(qiáng)有關(guān)，這些變化引起機(jī)體免疫耐受的破壞，