短鏈神經(jīng)毒素SN285兩個(gè)特異位點(diǎn)對(duì)活性的影響及機(jī)制分析.pdf

1、　　在青環(huán)海蛇毒腺cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一段編碼短鏈神經(jīng)毒素的基因，其編碼的毒素SN285具有獨(dú)特的序列，缺少在其他α-神經(jīng)毒素中高度保守的功能性殘基Asp31、Arg33(Ea序列)，在其同源位置上分別為Gly29、His31，為了解這兩個(gè)位點(diǎn)上非保守性氨基酸取代對(duì)毒素功能與活性的可能影響，本論文利用定點(diǎn)突變將這兩個(gè)位點(diǎn)分別或同時(shí)突變成為原來保守的殘基，突變體分別命名為：rMuD、rMuR、rMuDR?！　±帽緦?shí)驗(yàn)室構(gòu)建的原核融合表達(dá)

2、載體pTRX成功構(gòu)建了三個(gè)毒素突變體的重組表達(dá)載體，含T7啟動(dòng)子、目的基因上游為硫氧還蛋白TRX的編碼序列，融合伴體與目的蛋白間含6×His純化標(biāo)簽及蛋白酶切割位點(diǎn)。　　利用鎳離子螯合層析、蛋白酶PreScissionprotease切割、陽離子交換層析、凝膠過濾層析進(jìn)行幾步簡便高效的純化，最后得到電泳純的三種毒素突變體。　　利用大鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本檢測rSN285及三個(gè)毒素突變體的組織活性，以rSN311為陽性對(duì)照，五種毒素或突變

3、體均能阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)、抑制膈肌對(duì)刺激神經(jīng)引起的收縮反應(yīng)，但相互間的活性有明顯差異，對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)的阻斷活性依次為：rSN285＞rMuDR、rSN311＞rMuR＞rMuD，除rMuD作用濃度為2μm，其余毒素作用濃度均為1μM，在完全阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)后，rSN285及三個(gè)毒素突變體與受體解離的能力與程度有明顯差異，從受體解離的能力依次為：rMuD＞rSN285＞rMuR＞rMuDR?！　∫约毙苑蛛x的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元為標(biāo)本、采用全細(xì)胞膜片鉗