南美響尾蛇神經(jīng)毒素(Crotoxin)誘導(dǎo)NCI-H661細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察南美響尾蛇神經(jīng)毒素(crotoxin，CrTX)對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)抗腫瘤作用，以及對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤抗腫瘤作用，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：通過(guò)四唑鹽還原法(CCK-8)檢測(cè)南美響尾蛇神經(jīng)毒素(crotoxin)、吉非替尼(Gefinitib)及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，應(yīng)用細(xì)胞集落平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H66

2、1細(xì)胞的集落形成的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H661細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響，并檢測(cè)以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后NCI-H661細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的變化；應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定 crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)用對(duì) NCI-H661細(xì)胞內(nèi) p38MAPK、wtp53、phospho-p38MAPK

3、、bax、bcl-2及 caspase-3活性亞單位 p17蛋白表達(dá)水平影響，并測(cè)定以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì) NCI-H661細(xì)胞內(nèi)以上6種蛋白表達(dá)水平變化。將人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞接種裸鼠腋下建立荷瘤裸鼠模型。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組，crotoxin組、gefinitib組、crotoxin+gefiniti組、crotoxin+

4、SB203580組、crotoxin+PFT-α組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔注射給藥，每三天給藥一次，同時(shí)陰性對(duì)照組注射等量生理鹽水。給藥4周后完整取出皮下移植瘤結(jié)節(jié)，對(duì)比較不同干預(yù)組和對(duì)照組移植瘤瘤重，計(jì)算抑瘤率。
　　結(jié)果：Crotoxin對(duì)NCI-H661細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng)gefinitib抗腫瘤效果,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Crotoxin對(duì)NCI-H661細(xì)胞集落形

5、成有抑制作用，與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng)gefinitib對(duì)NCI-H661細(xì)胞集落形成抑制效果，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Crotoxin對(duì)人大細(xì)胞肺癌 NCI-H661細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯作用，且crotoxin與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng) gefinitib對(duì) NCI-H661細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期 G1期阻滯作用，以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后，cro

6、toxin誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯作用可被抑制。Western blot實(shí)驗(yàn)中crotoxin、 gefinitib、crotoxin+gefinitib組中 phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亞單位 P17、bax蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比表達(dá)增高，且crotoxin、 gefinitib組表達(dá)量接近，Crotoxin+Gefinitib組高于前兩者； bcl-2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)，且crotox

7、in+gefinitib組低于crotoxin、gefinitib組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。crotoxin+SB203580組中phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亞單位 P17、bax、bcl-2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Crotoxin+PFT-α組中phospho-P38MAPK、wtP53蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；caspase3活性亞單位 P17、bax、bcl-

8、2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組中 p38MAPK蛋白表達(dá)水平接近對(duì)照組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Crotoxin，gefinitib均對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高抑瘤作用,其抑瘤率分別是39.5％、43.7%及75.1%，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：Crotoxin對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞體外生長(zhǎng)有抑制作用，與gefini