間歇低氧對肝臟低密度脂蛋白受體相關蛋白1的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種常見的睡眠呼吸紊亂性疾病，與高血壓、冠心病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展關系密切，嚴重者可危及生命[1～3]。有研究證實，OSAS患者血脂譜異常，表現(xiàn)為甘油三脂（Triglycerides，TG）、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、極低密度脂蛋白(Very low density l

2、ipoprotein，VLDL)、低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein，LDL)均明顯升高，而高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)則降低，表明OSAS患者脂質代謝紊亂與其心血管疾病的發(fā)生有密切的關系[4-7]。
　　在OSAS患者中，由于夜間睡眠時反復出現(xiàn)呼吸停止，會導致低氧血癥、高碳酸血癥及睡眠質量低下，上述結果能引起呼吸、心血管、精神神經、血液、內分泌等多系統(tǒng)的病理生理

3、變化。因此，睡眠中間歇低氧(Intermittent hypoxia，IH)是OSAS病理生理機制的關鍵。有動物實驗表明，給予小鼠IH5天后，其血清TC、HDL及TG的水平增加，而4周之后LDL的水平亦增加[8,9]，且血脂升高的程度與低氧刺激的嚴重度呈正比[8]。因此，IH可能是OSAS患者高脂血癥的直接原因。
　　低密度脂蛋白受體相關蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related pr

4、otein1，LRP1)是一種內吞性的多功能受體，廣泛分布于肝細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、神經細胞等，以肝實質細胞中含量最豐富。能識別多種配體并在體內清除之。LRP1首先與其配體結合成復合物并被內吞入細胞，形成內體，然后配體在溶酶體內水解，LRP1則再回到細胞膜循環(huán)使用。LRP1在肝細胞表面的主要作用是與載脂蛋白E和乳糜微粒殘粒結合，LRP1還可以清除富含TG的脂蛋白殘粒，比如乳糜微粒殘粒和VLDL殘粒。因此，LRP1在脂質代謝中發(fā)揮重

5、要的作用。缺氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor1，HIF-1）是細胞在缺氧條件下產生的核蛋白，它與靶基因結合，促進其轉錄，使機體產生一系列缺氧適應反應。在機體缺氧狀態(tài)下可以誘導HIF-1的表達增加。HIF-1α是HIF-1的活性亞基。有研究表明，給予人平滑肌細胞低氧刺激后，其細胞內HIF-1α表達增加，從而進一步引起LRP1的表達增加[10]。
　　上述研究結果強烈提示，IH條件下肝細胞內HIF-1α及

6、LRP1的水平也可能發(fā)生上述變化，且LRP1的升高可能是通過HIF-1α介導的。本研究通過建立大鼠及人肝癌細胞株HepG2細胞系IH模型，模擬OSAS患者的主要病理生理變化。(1)評價不同作用時間的IH對大鼠血脂的影響以及IH條件下大鼠肝臟LRP1與HIF-1α的變化。(2)評價IH條件下人肝癌細胞株HepG2細胞系LRP1以及HIF-1α的變化，并探討該變化的可能機制。(3)評價IH條件下給予阿托伐他汀(Atorvastatin，A)

7、干預后人肝癌細胞株HepG2細胞系LRP1以及HIF-1α的變化，探討阿托伐他汀治療OSAS脂質代謝紊亂的又一可能機制。
　　方法：
　　一、實驗動物
　　成年雄性SD大鼠，體重300-350g，分為五組，1周組(1w)、2周組(2w)、3周組(3w)，4周組(4w)和對照組(C)，通過IH裝置進行IH干預。干預后留取肝臟、血清標本。
　　二、人肝癌細胞株HepG2細胞系
　　體外培養(yǎng)HepG2細胞系，分成

8、3部分進行:一部分細胞在對數(shù)生長期進行IH干預;一部分細胞先用YC-1進行預處理，然后再IH干預;第三部分細胞應用阿托伐他汀干預后進行IH干預。以上組別均設定空白對照。留取干預后的細胞進行分析。
　　三、Real-time RT-PCR
　　采用Trizol試劑提取大鼠肝細胞和HepG2細胞系中的總RNA，利用Real-timeRT-PCR試劑盒進行Real-time RT-PCR，應用7500Fast Real-Time

9、PCR System進行擴增，并分析結果。
　　四、Western-blot
　　將總蛋白的裂解產物進行SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，配置一抗稀釋液LRP11∶500，HIF-1α1∶500，β-actin1∶5000。將條帶應用TTBS略加清洗后分別放入一抗稀釋液中，搖床上4℃雜交過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶2000)搖床上室溫雜交1h后，ECL法顯影。
　　五、統(tǒng)計分析
　　用S

10、PSS18.0統(tǒng)計包進行統(tǒng)計學分析，當P＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　一、IH大鼠體重和進食量的變化
　　每組大鼠初始體重之間不存在顯著差異，體重均隨著時間的推移逐漸增加，且各組之間體重增加的幅度一致，各組之間在相同的時間點進行體重的比較，未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異（P＞0.05）。
　　二、IH大鼠血清TG、TC、LDL、HDL的變化
　　大鼠血清HDL在IH干預達到3周時出現(xiàn)了升高，在第4周時

11、進一步升高。大鼠血清TC在IH干預達到3、4周時出現(xiàn)了升高，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。大鼠血清LDL隨著IH干預時間的延長，雖然有逐漸上升的趨勢，但各組之間進行比較未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。大鼠血清TG在IH干預達到4周時出現(xiàn)了升高，與對照組和干預1周組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　三、IH大鼠肝臟LRP1、HIF-1α蛋白的變化
　　LRP1蛋白在IH2周后即出現(xiàn)統(tǒng)計學意義上的升高，并保持升高水平至4周。

12、HIF-1α蛋白則從IH1周開始就出現(xiàn)升高，且維持在升高狀態(tài)。
　　四、IH干預后HepG2細胞LRP1和HIF-1α的變化
　　與對照組比較，IH干預后的HepG2細胞LRP1 mRNA和蛋白，HIF-1αmRNA和蛋白的表達均明顯升高（P＜0.05）。
　　五、YC-1聯(lián)合IH干預后HepG2細胞LRP1和HIF-1α的變化
　　與IH組相比，IH+YC-1組HepG2細胞LRP1 mRNA及蛋白的表達明顯下

13、降(P＜0.05)。IH+YC-1組HepG2細胞HIF-1αmRNA的表達與IH組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而HIF-1α蛋白的表達與IH組相比明顯下降(P＜0.05)。
　　六、給予阿托伐他汀(A)干預后，間歇低氧條件下HepG2細胞LRP1和ⅢF-1α的表達變化
　　與IH組相比，IH+A組LRP1 mRNA及蛋白的表達明顯升高;與IH+A組相比，IH+A+YC-1組LRP1 mRNA及蛋白的表達明顯降低。

14、與IH組相比，IH+A組HIF-1α mRNA的表達無明顯改變，但HIF-1α蛋白的表達明顯升高。與IH+A組相比，IH+A+YC-1組的HIF-1α蛋白表達明顯的下降。
　　結論：
　　1.IH導致大鼠部分血脂指標HDL、TG、TC升高，但不伴有體重和進食量的相應變化，且IH對血脂HDL、TG、TC的影響呈時間依賴性。
　　2.IH條件下大鼠肝臟LRP1和HIF-1α的表達水平明顯升高，且HIF-1α的升高先于LRP

15、1的升高。
　　3.IH條件下，人肝癌細胞株HepG2細胞LRP1和HIF-1α的表達明顯增加。
　　4.給予HIF-1α特異性抑制劑YC-1處理后，人肝癌細胞株HepG2細胞HIF-1α的表達明顯下降，同時LRP1的表達也明顯減少。證實IH引起的LRP1表達上調是通過HIF-1α介導的。
　　5.給予阿托伐他汀干預后，IH作用下的HepG2細胞HIF-1αmRNA的表達水平無明顯改變，但HIF-1α的蛋白水平明顯增加