圍產(chǎn)期奶牛肝低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、本文通過圍產(chǎn)期健康奶牛飼養(yǎng)試驗(yàn)、體外奶牛肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，從細(xì)胞水平和分子水平，探討了能量狀態(tài)、神經(jīng)內(nèi)分泌因子和代謝產(chǎn)物對(duì)奶牛肝低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)理，為防治奶牛脂肪肝等圍產(chǎn)期能量代謝障礙性提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 奶牛飼養(yǎng)試驗(yàn)：選取30頭5-8歲、3-5胎泌乳量7000Kg左右的妊娠荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為3組，預(yù)飼一周后，分別于產(chǎn)前28d開始飼喂按中國(guó)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2

2、000)配制的標(biāo)準(zhǔn)日糧(對(duì)照組)、標(biāo)準(zhǔn)日糧能量增加20﹪日糧和標(biāo)準(zhǔn)日糧能量減少20﹪日糧，產(chǎn)后各組均按中國(guó)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制的產(chǎn)奶日糧飼喂。整個(gè)試驗(yàn)期間每日早、中、晚定時(shí)飼喂，至產(chǎn)后56d結(jié)束。在試驗(yàn)期產(chǎn)前28d、14d和產(chǎn)后1d、14d、28d及56d，分別采取肝臟組織，應(yīng)用半定量RT-PCR法測(cè)定肝組織中LDLR基因的mRNA豐度。結(jié)果表明：干乳期低能顯著上調(diào)奶牛圍產(chǎn)期肝臟LDLRmRNA水平，干乳期正常和高能飼喂顯著上調(diào)奶牛產(chǎn)后肝組

3、織LDLRmRNA豐度，且顯著低于低能組，但產(chǎn)后14d后各組奶牛肝LDLRmRNA水平均顯著降低，說明一方面奶牛產(chǎn)后肝TG含量增加可能抑制了LDLRmRNA表達(dá)，另一方面產(chǎn)后LDLRmRNA水平提高可能阻礙了VLDL的組裝與分泌，這也可能是低能組奶牛產(chǎn)后肝TG含量增加的原因，肝LDLRmRNA的表達(dá)水平可能是奶牛肝VLDL在泌乳初期組裝和分泌的主要調(diào)節(jié)因素之一，但干乳期低能飼喂上調(diào)奶牛圍產(chǎn)期肝LDLRmRNA豐度的原因還有待進(jìn)一步探討。

4、 肝細(xì)胞體外原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：選取臨床檢查無異常的未哺乳新生牛，頸動(dòng)脈放血致死，無菌條件下采取肝臟后葉組織，采用剪切消化法分離肝細(xì)胞，按每孔106個(gè)/mL接種多聚賴氨酸包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃，5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞完全貼壁可進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用半定量RT-PCR方法，測(cè)定了細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的胰島素(0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol

5、/L、1000nmol/L)、胰高血糖素(0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L)和瘦蛋白(0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL)對(duì)新生犢牛原代培養(yǎng)肝細(xì)胞LDLRmRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明：①隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素濃度的增加，肝細(xì)胞中LDLRmRNA的表達(dá)水平隨之升高。說明胰島素促進(jìn)LDLRmRNA表達(dá)；②胰高血糖素對(duì)肝細(xì)胞LDLRmRNA

6、表達(dá)具有抑制作用，隨劑量增加其抑制作用增強(qiáng)；③不同濃度的瘦蛋白對(duì)肝細(xì)胞LDLRmRNA表達(dá)無劑量依賴性影響。 采用半定量RT-PCR方法，測(cè)定了細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的NEFA(0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L)、BHBA(0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L)和葡萄培(0mmol/L、1.5mmol/L、2