PI3-k-Akt shRNA對大鼠Thy-1腎炎增生病變的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 P13-k/Akt shRNA真核表達質粒的構建及鑒定目的:構建并鑒定針對P13-k/Akt基因的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達載體,探討沉默大鼠腎組織內P13-k/Akt)基因對Thy-1腎炎(Tny-1N)增生病變的影響。方法:用DNA重組技術將針對大鼠P13-k/Akt基因不同位點所設計N8對shRNA序列克隆到真核表達質粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列測定后,用脂質體轉染至大鼠GMCs中,Weste

2、m blotting檢測蛋白的相對表達量來篩選最佳沉默效率的shRNA。結果:限制性酶切及核酸序列分析表明,重組質粒構建正確。Western blotting證實,在多種重組質粒中,以shPik3c3-2、shAkt1-4具有最佳的沉默效率。結論:成功構建了P13-k/Akt shRNA的真核表達質粒,該結果為進一步體內研究沉默P13-k/Akt信號通路基因對Thy-1 N病變的抑制作用奠定了實驗基礎。 第二部分沉默PI3-k/

3、Akt信號通路對Thy-1 N增生病變的影響目的:探討用發(fā)夾狀小干涉RNA(shRNA)沉默大鼠腎組織內P13-k/Akt基因對Thy一1N增生病變的影響。方法:用水流動力學注射法將shPik3c3-2、shAkt1-4導入大鼠Thy-1 N腎組織,以Real-time PCR檢測大鼠腎皮質中血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1,Tsp-1)、轉化生長因子-beta 1(Transforming growth facto

4、r-β1,TGF-β1)、細胞周期蛋白(cyclin D2)和纖維連接蛋白(Fibronectin,F(xiàn)N)mRNA豐度,Westem blotting和免疫組化檢測P-Akt、T-Akt、Tsp-1、TGF-β1、cyclin D2和FN蛋白表達水平。此外,實驗還觀察了大鼠腎臟組織病理學及24h尿蛋白的變化。結果:將shPik3c3-2、shAkt1-4導A.Thy-1 N大鼠腎組織后,發(fā)現(xiàn)大鼠腎皮質中P-Akt和T-Akt蛋白表達水平

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