PI3-k-Akt shRNA對(duì)大鼠Thy-1腎炎增生病變的影響.pdf

1、第一部分 P13-k/Akt shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定目的：構(gòu)建并鑒定針對(duì)P13-k/Akt基因的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達(dá)載體，探討沉默大鼠腎組織內(nèi)P13-k/Akt)基因?qū)hy-1腎炎(Tny-1N)增生病變的影響。方法：用DNA重組技術(shù)將針對(duì)大鼠P13-k/Akt基因不同位點(diǎn)所設(shè)計(jì)N8對(duì)shRNA序列克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列測(cè)定后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至大鼠GMCs中，Weste

2、m blotting檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量來(lái)篩選最佳沉默效率的shRNA。結(jié)果：限制性酶切及核酸序列分析表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。Western blotting證實(shí)，在多種重組質(zhì)粒中，以shPik3c3-2、shAkt1-4具有最佳的沉默效率。結(jié)論：成功構(gòu)建了P13-k/Akt shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，該結(jié)果為進(jìn)一步體內(nèi)研究沉默P13-k/Akt信號(hào)通路基因?qū)hy-1 N病變的抑制作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分沉默PI3-k/

3、Akt信號(hào)通路對(duì)Thy-1 N增生病變的影響目的：探討用發(fā)夾狀小干涉RNA(shRNA)沉默大鼠腎組織內(nèi)P13-k/Akt基因?qū)hy一1N增生病變的影響。方法：用水流動(dòng)力學(xué)注射法將shPik3c3-2、shAkt1-4導(dǎo)入大鼠Thy-1 N腎組織，以Real-time PCR檢測(cè)大鼠腎皮質(zhì)中血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1，Tsp-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta 1(Transforming growth facto

4、r-β1，TGF-β1)、細(xì)胞周期蛋白(cyclin D2)和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)mRNA豐度，Westem blotting和免疫組化檢測(cè)P-Akt、T-Akt、Tsp-1、TGF-β1、cyclin D2和FN蛋白表達(dá)水平。此外，實(shí)驗(yàn)還觀察了大鼠腎臟組織病理學(xué)及24h尿蛋白的變化。結(jié)果：將shPik3c3-2、shAkt1-4導(dǎo)A.Thy-1 N大鼠腎組織后，發(fā)現(xiàn)大鼠腎皮質(zhì)中P-Akt和T-Akt蛋白表達(dá)水平