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文檔簡介
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respi ratory syndromevirus,PRRSV)屬于尼多病毒目動脈炎病毒科,它主要引起母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖障礙,仔豬、育肥豬呼吸困難及育成豬類流感疾病,此外該病毒持續(xù)性感染,可引起免疫抑制,成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)安全的重要病原之一。然而,目前疫苗的使用只能夠提供部分保護使機體不再出現(xiàn)臨床癥狀,不能夠阻止感染,因此,迫切需要開發(fā)一種新型的、能對所有PR
2、RSV病毒株提供保護的抗病毒措施。 RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的信使RNA(mRNA)序列特異性消減現(xiàn)象,是一種保守的抗病毒機制,已發(fā)現(xiàn)于線蟲、植物和哺乳動物中。將21~2 3nt的小分子干擾RNA雙鏈(sma ll interfererlce RNA,s iRNA)或載體DNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾RNA (shor thairpin RNAs,shRNAs)導(dǎo)入細胞,可以抑制同源的內(nèi)源或病原mRNA的表達。近幾年,RN
3、Ai技術(shù)已被用于干擾HBV、HCV、流感和其他人類病毒的感染研究,提示RNAi作為一個有效的抗病毒策略,具有很大應(yīng)用前景,但是目前對于PRRSV是否存在RNA干擾現(xiàn)象,究竟哪些基因哪些序列是合適的靶標,shRNA對PRRsV抑制有哪些特征等等,尚沒有這方面的研究。 為了探討psUPER質(zhì)粒能否有效表達發(fā)夾小干擾RNA(shRNA),作為RNAi研究的平臺,本研究利用RNA干擾技術(shù),以A型流感病毒核衣殼蛋白(NP)基因為靶基因,選
4、用已知的有高效抑制效果的siRNA片段,設(shè)計有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸序列,經(jīng)退火成互補雙鏈,再克隆至質(zhì)粒pSUPER中,經(jīng)酶切鑒定和測序證實表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,命名為pSUPER-NP。將該表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(cEF),24h后用A型流感病毒感染,病毒感染40h后觀察細胞病變,測定病毒血凝效價和TCID<,50>,發(fā)現(xiàn)psUPER-NP能夠阻止細胞病變的出現(xiàn),pSUPER-NP轉(zhuǎn)染孔的血凝價和TcID<,50>均顯著下降,表明該
5、表達質(zhì)粒能抑制流感病毒的復(fù)制,pSUPER質(zhì)??梢詰?yīng)用于哺乳動物高效的RNAi研究,也為探索流感病毒致病機理和開發(fā)基因治療新途徑奠定了基礎(chǔ)。 RNAi抑制效果的正確評價,需要合適的檢測方法,為了建立靈敏、快速的mRNA檢測方法,本研究設(shè)計合成了一套引物和TaqMan探針,以擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核衣殼蛋白基因,通過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了快速定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的實時PCR方法,并用該法檢測患病豬的肺臟等樣品。結(jié)果
6、表明該方法具有較好的特異性和重復(fù)性,對PRRsV細胞培養(yǎng)物的檢測下限為0.01TcID<,50>,敏感性比常規(guī)RT-PCR高100倍;對10份PRRS疑似豬肺臟樣品檢測5份為陽性,與病毒分離的陽性符合率為100%。該方法具有快速、靈敏、準確、低污染等優(yōu)點,在PRRSV的早期檢測、預(yù)防控制、進出口檢疫及基礎(chǔ)研究中會起到重要作用。轉(zhuǎn)染效率低是阻礙siRNA介導(dǎo)的基因沉默效果的重要因素,為了實現(xiàn)質(zhì)粒在Marc145細胞中的最佳轉(zhuǎn)染,本研究以熒
7、光質(zhì)粒pEGFP為報告質(zhì)粒,通過對轉(zhuǎn)染試劑的選擇、脂質(zhì)體質(zhì)粒比例、細胞密度和最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的優(yōu)化,確定了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc145細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件,即轉(zhuǎn)染前24h將96孔板每孔鋪10><'4>個細胞,轉(zhuǎn)染前4h將細胞換液,轉(zhuǎn)染時TransFast<'TM> Transfection Reagent與質(zhì)粒比(μL/μg)為3:1,每孔轉(zhuǎn)染0.4μg的pEGFP(24孔板每孔1.0μg)時,轉(zhuǎn)染孔的熒光數(shù)最多,熒光強度最大,轉(zhuǎn)染效率最高,從而
8、為下一步的shRNA表達質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)染Marc145細胞奠定了基礎(chǔ)。 不同基因不同區(qū)域上的siRNA抑制基因表達的能力差異很大,為了篩選PRRSV基因組上功能性的shRNA分子,本研究利用Ambion公司的在線設(shè)計工具httD:www.a(chǎn)mbion.com/techlib/misc/siRNA design html,根據(jù)siRNA設(shè)計原則,選擇了針對PRRSV S1株P(guān)A、GP5、M、N基因及5’UTR序列的14個siRNA靶序
9、列,經(jīng)BLAST驗證,所選擇的靶序列與豬體和其他病毒基因片段無同源性。根據(jù)pSUPER載體要求,合成了14對互補的寡核苷酸,寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為:5’端19個核苷酸為siRNA的正義鏈,中間加入9個核苷酸TTCAAGAGA間隔以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),19個核苷酸siRNA的反義鏈,3’端加有轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTT。并且正義鏈寡核苷酸5’端帶有Bg1Ⅱ(GATC)酶切位點粘性末端,反義鏈寡核苷酸5’端帶有Xho Ⅰ(TCGA)酶切位點粘性末端。將各對
10、寡核苷酸分別退火,克隆到pSUPER載體上。經(jīng)EeoR I/Kpn I雙酶切鑒定和測序鑒定后,證明已成功構(gòu)建了針對相應(yīng)基因不同區(qū)域的shRNA(small hairPin RNA)表達質(zhì)粒。為進一步進行RNA干擾試驗奠定了基礎(chǔ)。 為了驗證上述構(gòu)建的shRNA表達質(zhì)粒表達的shRNA對靶基因表達的抑制,本研究首先根據(jù)PRRSV S1株病毒基因組序列設(shè)計5對特異性引物,分別擴增GP5、M、N基因及PA和5’UTR部分序列,經(jīng)Hind
11、Ⅲ/BamH I克隆到pEGFP-N1載體,構(gòu)建了5個EGFP融合表達質(zhì)粒。將融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細胞,分別在24h,48h,72h觀察熒光的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各蛋白均得到了表達,轉(zhuǎn)染后24h就可見到熒光,48h熒光增強,72h最強,然后逐漸減弱;p1b-EGFP-N1、pUTR-EGFP-N1、pGP5-EGFP-N1表達的蛋白主要在胞漿,呈彌散狀充盈整個細胞;而pN-EGFP-N1轉(zhuǎn)染的孔熒光主要在胞漿和胞核;pM-EGFP-
12、N1表達的蛋白24h在胞漿和核周區(qū),呈圓圈狀,有的在核周兩極濃染,48h-72h主要集中在胞漿和核仁。將shRNA表達質(zhì)粒與構(gòu)建的融合表達質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞,分別在轉(zhuǎn)染后48h觀察熒光的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),shRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞的孔熒光均有不同程度的減弱,熒光細胞數(shù)減少,其中pSUPER-N3、pSUPER-G1、pSUPER-G2、pSUPER-M2、pSUPER-M3、pSUPER-P2、pSUPER-P3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染
13、的孔熒光減少得較為明顯。將shRNA表達質(zhì)粒與表達PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M和N的pCDNA3真核表達質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞,通過半定量PCR檢測在mRNA水平上來驗證這些shRNA表達載體對結(jié)構(gòu)基因表達的抑制,結(jié)果表明GP5、M和N蛋白基因shRNA表達載體對其各自蛋白的抑制率為36%-69%,其中pSUPER-N3和pSUPER-GI抑制效果最為顯著。為了探討上述有顯著抑制效果的shRNh對PRRSV復(fù)制的抑制作用,
14、本研究將7個靶向PRRSV基因組中的GP5和N蛋白基因shRNA表達質(zhì)粒和pSUPER轉(zhuǎn)染Marcl45細胞,研究靶向PRRSV基因組中的GP5和N蛋白基因的shRNA抑制PRRSV在Marcl45細胞中復(fù)制的情況。結(jié)果表明shRNA表達質(zhì)粒表達的shRNA在PRRSV感染后48h對病毒復(fù)制的抑制達到10-1000倍,其中pSUPER-N3、pSUPER-G1的抑制效果最為明顯,將這兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Marc145細胞,發(fā)現(xiàn)能夠提高shRN
15、A對病毒的抑制作用,表明shRNA表達質(zhì)粒對病毒復(fù)制的抑制作用具有相加性,而且這種抑制作用能持續(xù)到感染后4d。通過對SiRNA點突變,構(gòu)建了靶向同一序列的突變體shRNA表達質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染Marcl45細胞,病毒的復(fù)制不受其影響,表明這種抑制作用序列特異性。將不同劑量的pSUPER-N3或pSUPER-G1轉(zhuǎn)染Marcl45細胞,發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加shRNA對病毒復(fù)制的抑制作用也有所增強,呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制,而且用shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)
16、染已經(jīng)感染PRRSV的Marcl45細胞,病毒的復(fù)制也得到了抑制,這些研究表明靶向PRRSV基因組不同區(qū)域的siRNA可以作為控制該病毒傳播的候選策略。本研究也觀察了靶向PRRSV基因組5'UTR及PA、M基因的siRNA抑制PRRSV在Marc145細胞中的復(fù)制,以進一步篩選PRRSV基因組5'UTR及PA、M基因上的功能性shRNA。將shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marcl45細胞,24h后用PRRSV感染,病毒感染后48h通過間接免疫熒
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