利用RNA干擾機(jī)制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文利用RNA干擾機(jī)制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖姓名：高曉飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陳溥言20050601全文摘要利用RNA干擾機(jī)制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖摘要利用PCR方法擴(kuò)增出了PRRSVVR2332resP林的核衣殼蛋白基因(N基因)，并克隆迸熒光表達(dá)載體pEGFPN1中，利用卡那抗性篩選得到重組陽(yáng)性克隆，經(jīng)雙酶切鑒定成功后，命名為pEGFPNI—ORF7。根據(jù)麻省理工學(xué)院和Amb

2、ion公司網(wǎng)站提供的RNAi靶位點(diǎn)選擇軟件，以及2004年Nature文獻(xiàn)，選定PRRSVVR2332resp株N基因兩處靶位點(diǎn)，并且提交NCBI的BLAST系統(tǒng)證明其與其它物種的低同源性后，設(shè)計(jì)合成六條單鏈，兩兩退火后克隆八RNA干擾載體pBS／U610中，利用氨芐抗性篩選，并經(jīng)缺失酶切位點(diǎn)Xhol鑒定，得到兩個(gè)干擾裁體pBS／U6—60和pBS／U6—260，以及一個(gè)對(duì)照載體pBS／U6Neg將真核表達(dá)熒光載體pEGFP—NIORF

3、7分別與pBS／U6—60，pBS／U6—260以及對(duì)照裁體pBS／U6一COntrei共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，16小時(shí)后檢測(cè)，通過GFP表達(dá)數(shù)量以及用Western—blot鑒定GFP具體表達(dá)量的對(duì)比，觀察到pBS／U6—60，pBS／U6—260對(duì)pEGFP—N卜ORF7的表達(dá)有明顯的抑制作用，并用RT—PCR確定表達(dá)產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，證明本實(shí)驗(yàn)中干擾載體的高度特異性。定量分析Western—blot條帶，結(jié)果表明pBS／U660，p

4、BS／U6260對(duì)N基因的干擾效果分別為8290％和6995％。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，RNAi可以對(duì)PRRSVN基因的表達(dá)產(chǎn)生干擾作用，提出所選取的靶位點(diǎn)可能是兩個(gè)對(duì)PRRSV全病毒復(fù)制起抑制作用的潛在位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染pEGFPNI熒光載體進(jìn)入MARC145細(xì)胞系，摸索真核表達(dá)載體在MARC145細(xì)胞中高效表達(dá)的奈件，為RNA干擾栽體在MARC一145細(xì)胞中成功執(zhí)行生物學(xué)功能做鋪墊。設(shè)定不同的PRRSV病毒接毒量和不同的接毒時(shí)間，將干擾載體p

5、BS／U6—60和pBS／U6—260以及對(duì)照載體pBS／U6一tteg轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞MARC145中，成功檢測(cè)到pBS／U6—60和pBS／U6—260在MARC一145細(xì)胞中對(duì)PRRSV病毒增殖的抑制現(xiàn)象。選取轉(zhuǎn)染前后不同時(shí)間段的病毒上清做病毒TCID50測(cè)定，觀察CPE并利用IFA檢測(cè)，得到pBS／U660和pBS／U6—260抑制PRRSVVR2332resP株增殖作用的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，顯示RNA干擾技術(shù)可以在72到120小時(shí)顯著抑

6、制PRRsv的繁殖，在預(yù)防和治療上都有顯著效果。選取接毒后72小時(shí)，對(duì)病毒中N基因的表達(dá)情況進(jìn)行Western—blot鑒定，結(jié)果顯示，pBS／D660干擾FRRSVVR2332Resl3株N基因表達(dá)的效率可以達(dá)到7015％。最終，(I)證實(shí)在真核細(xì)胞水平上，可以利用RNA干擾機(jī)制抑制PRRSVVR2332resp株的增殖；(】1)提出在所選PRRSVVR2332resP株N基因的兩處靶位點(diǎn)序列中，存在病毒復(fù)制的關(guān)鍵性作用位點(diǎn)的觀點(diǎn)：(