豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒疫苗免疫候選分子研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，又稱“豬藍耳病”，本病以妊娠母豬的繁殖障礙(后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病(間質(zhì)性肺炎)為特征。本病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，現(xiàn)已成為危害規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疫病之一。目前，已有商品化的弱毒疫苗和滅活苗用于PRRS的防制，但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保護.PRRSV屬于尼多病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬

2、成員，為有囊膜、單股正鏈RNA病毒，其致病機理和免疫特性尚不十分清楚。 本研究設計構建了表達PRRSV膜相關蛋白GP3、GP4、GP5和M蛋白的重組腺病毒，通過小鼠免疫試驗篩選了PRRSV重組腺病毒免疫候選分子，為PRRSV基因工程疫苗研究奠定了基礎。 1．PRRSV CTL細胞免疫檢測方法的建立 為了探討PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白基因誘導細胞毒T淋巴細胞(CTL)應答的能力，建立一種非放射性、簡

3、便易行的檢測特異性CTL的方法，應用RT-PCR方法擴增得到GP3、GP4、GP5和M蛋白基因并克隆入真核表達載體pcDNA3，構建重組表達質(zhì)粒pcDNA3-GP3、pcDNA3-GP4、pcDNA3-GP5和pcDNA3-M。將重組質(zhì)粒轉染至NIH3T3細胞，G418篩選克隆，經(jīng)間接免疫熒光試驗(IFA)檢測目的蛋白表達，成功培育了4株能分別表達PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白的細胞株NIH3T3/GP3、NIH3T3/GP

4、4、NIH3T3/GP5和NIH3T3/M，可作為PRRSV CTL，檢測方法中的靶細胞。以NIH3T3細胞為靶細胞確定了最適靶細胞數(shù)(2×10<'5>/mL)，建立了檢測PRRSV特異性細胞毒T淋巴細胞的殺傷效應的乳酸脫氫酶釋放法。 2．PRRSV M與GP5蛋白融合表達及其免疫特性研究 為了提高GP5蛋白的免疫原性，在構建了表達GP5蛋白重組腺病毒的基礎上，將PRRSV的M蛋白與GP5融合表達，間接免疫熒光試驗和We

5、stern blot證明，成功構建了融合表達M與GP5蛋白的重組腺病毒(rAd-M-GP5)。取120只BALB/c小鼠，隨機分成5組，每組24只，將重組腺病毒rAd-GP5(表達GP5蛋白)、rAd-M(表達M蛋白)和rAd-M-GP5(表達M-GP5融合蛋白)免疫小鼠，間隔兩周加強免疫一次．對照組分別注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS，觀察56天，間隔2周檢測PRRSV中和抗體，比較其細胞免疫水平，結果為：加強免疫后2周rAd-M

6、-GP5免疫組中和抗體滴度明顯高于rAd-GP5免疫組，抗體效價達到1：102(56dpi)。同時，免疫rAd-M-GP5的小鼠產(chǎn)生了比tad-M(28％)更高水平的PRRSV特異的CTL反應，達到36.2％(42dpi)，而rAd-GP5產(chǎn)生的PRRSV特異的應答較低。該結果說明，M與GP5融合后能顯著增強GP5蛋白誘導的體液免疫應答和細胞免疫應答。 3．GP3蛋白的信號肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響 次要

7、結構蛋白GP3與免疫保護有關，但是其免疫特性知之甚少。為了研究信號肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響，構建了表達缺失該區(qū)域(aa2～64)的GP3蛋白的重組腺病毒(rAd-tGP3)，并將其免疫特性與GP3進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，小鼠在加強免疫重組腺病毒rAd-tGP3和rAd-GP3后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的細胞免疫應答，包括T細胞增殖和細胞毒T細胞應答。而且，免疫rAd-tGP3的小鼠的應答水平(中和抗體1：14、SI為4.5

8、、殺傷率為36％(56dpi))明顯高于rAd-GP3免疫組(中和抗體1：10、SI為3.3、殺傷率為28％(56dpi))．表明GP3蛋白的前64個氨基酸對GP3蛋白的構象和抗原結構可能有重要影響。 4．GP3和GP4蛋白對GP5蛋白的協(xié)同免疫特性研究 為了研究GP3或GP4蛋白能否協(xié)同GP5蛋白的免疫原性，分別將GP3、GP4、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達，間接免疫熒光試驗和western blot證明，成功構

9、建了融合表達GP3-GP5(rAd-GP3-GP5)、GP4-GP5(rAd-GP4-GP5)以及GP3-GP4-GP5(rAd-GP3-GP4-GP5)的重組腺病毒。同時還構建了2株重組腺病毒，分別表達單個的GP3和GP4蛋白。將重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，間隔兩周加強免疫一次。對照組分別注射wtAd或PBS。結果發(fā)現(xiàn)，小鼠在加強免疫后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的體液和細胞免疫應答。然而，只有免疫rAd-GP3-GP5、rAd-GP

10、4-GP5、rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了高滴度的中和抗體，效價分別達到1：82、1：96、1：120(56dpi)，并誘導較強的淋巴細胞增殖。同時，相對于rAd-GP3(21.4％)和rAd-GP5(18％)免疫組，免疫rAd-GP3-GP5和rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了更高水平的PRRSV特異的CTL反應，殺傷效率分別為37.5％和44.7％(42dpi)。說明GP3蛋白或GP3與GP4蛋白對GP5蛋白的體

11、液免疫和細胞免疫有協(xié)同促進作用。 5．GP5蛋白信號肽和非中和表位對其誘導中和抗體應答的影響 為了研究GP5蛋白的信號肽和非中和表位對其誘導中和抗體的影響，構建了表達缺失非中和表位(A)和/或信號肽序列的GP5蛋白的3個重組腺病毒，利用BALB/c小鼠評估它們誘導體液免疫應答的特性。即：表達缺失非中和表位(aa27-31)的GP5(rAd-GP5△27/31)、表達缺失A表位及A表位與中和表位(B)中間的序列(aa27-

12、36)的GP5(rAd-GP5△27/36)、以及表達缺失B表位之前的序列(包括信號肽，aa2-36)的突變體(rAd-GP5△2/36)。結果為：3株重組體接種小鼠后均產(chǎn)生了明顯的抗PRRSV抗體的應答和明顯的中和抗體，其滴度達到1：30、1：19、1：14(56dpi)，明顯高于表達野生型GP5的重組腺病毒rAd-GP5誘導的中和抗體(1：8)．表明去除GP5蛋白A表位能提高其誘導產(chǎn)生中和抗體，而且，信號肽序列及A表位周圍的序列能影

13、響中和抗體的產(chǎn)生水平。 6．GP5蛋白N-糖基對其誘導中和抗體應答的影響 對于一些病毒來說，如HIV、SIV和HBV，“糖基屏蔽效應”可能是病毒逃避中和免疫應答的一個主要機理，使得病毒在體內(nèi)持續(xù)感染。PRRSV GP5蛋白含有4個糖基化位點，分別位于N30、N33、N44、N51。為了研究各位點的糖基對GP5蛋白免疫特性的影響，本研究共構建了6個重組腺病毒，分別為表達野生型的GP5以及突變1-4個糖基化位點的突變體： r

14、Ad-GP5(wtGP5)、 rAd-GP5N44S(N44S)、rAd-GP5N44/51S(N44/51S) 、 rAd-GP5N30/N44/51S(N30/44/51S) 、rAd-GP5N30/N33/N44/51S(N30/33/44/51S)和rAd-GP5N30/N33S(N30/33S)。小鼠免疫試驗結果為：5株表達GP5糖基化位點突變的重組體均可誘導產(chǎn)生較高水平的抗PRRSVELISA抗體，中和抗體水平明顯高于野生型

15、GP5重組腺病毒，說明，4個糖基化位點都能影響到GP5蛋白誘導中和抗體的能力。而且，rAd-GP5N30/N33s誘導的中和抗體滴度高于rAd-GP5N44S、 rAd-GP5N44/51S、 rAd-GP5N30/N44/51S，而低于rAd-GP5N30/N33/N44/51S，由于N30和N33殘基上的糖基靠近GP5蛋白的非中和表位(aa27～30)，說明N30和N33這2個位點對誘導中和抗體非常重要．此外，野生型GP5和糖基化位

16、點突變體誘導的淋巴細胞增殖應答沒有明顯的差異，說明，4個糖基化位點對GP5蛋白細胞免疫特性無明顯影響。 綜上所述，PRRSV M與GP5、GP3與GP5、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達后，能明顯提高其誘導的中和抗體水平和細胞免疫應答；GP5蛋白的糖基化位點和非中和表位能明顯影響其誘導中和抗體的能力；GP3蛋白具有較強的細胞免疫特性，從而為PRRSV重組腺病毒疫苗免疫候選分子設計提供了理論依據(jù)，為研究安全有效的PRRSV新型疫