腸梗阻導(dǎo)致腸功能障礙的中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究Ⅱ.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：腸梗阻導(dǎo)致腸功能障礙中腸上皮、腸免疫屏障及微生態(tài)的時(shí)相性研究 實(shí)驗(yàn)一:家兔可復(fù)性腸梗阻造模方式及材料的改良 目的：在前期實(shí)驗(yàn)建立的家兔機(jī)械性腸梗阻的基礎(chǔ)上進(jìn)行梗阻方式和材料的改良，使模型操作更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)、效果更穩(wěn)定。 方法：改用“腸管外壓迫”的方式，將輸液器部件改造成體外牽拉式鎖扣，在末段回腸腸系膜無(wú)血管區(qū)戳孔，套住腸管，引出切口旁腹壁外。手術(shù)1～2天后由體外牽拉鎖扣固定，

2、造成該部位腸管的閉塞梗阻。解除梗阻時(shí)只需剪斷鎖扣后抽出裝置。同時(shí)對(duì)體外水囊充注式梗阻裝置、塑封鋼纜圈套器等方法也進(jìn)行了嘗試。 結(jié)果：該方法在造成梗阻的安全性、確切性等方面較原模型更優(yōu)，避免了原方法所存在的腹腔感染、腸粘連、腸套疊以及腸穿孔等意外情況，并且不存在裝置脫落等不穩(wěn)定因素。 結(jié)論：在獲得更確切穩(wěn)定的梗阻效果的基礎(chǔ)上，改良后的方法創(chuàng)傷更小、造模周期更短，操作簡(jiǎn)單且材料經(jīng)濟(jì)，是較為理想的可復(fù)性機(jī)械性完全性腸梗阻模型。

3、 實(shí)驗(yàn)二:腸梗阻對(duì)小腸上皮細(xì)胞的損害及其增殖修復(fù)能力的影響 目的：觀察急性機(jī)械性低位小腸梗阻對(duì)于小腸上皮損害程度以及其自身再增殖、修復(fù)能力的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Norm）、假手術(shù)組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。分別對(duì)各組動(dòng)物血清瓜氨酸水平、生化、小腸組織

4、鳥氨酸脫羧酶活性，以及小腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量變化進(jìn)行檢測(cè)和觀察。 結(jié)果：腸梗阻后早期腸上皮細(xì)胞存在保護(hù)性的增殖加速過程，表現(xiàn)為ODC活性在梗阻后6h開始增高（p<0.001），隨著梗阻未解除，損害因素不斷加重，ODC活性在梗阻24h下降，至72h甚至低于正常水平。對(duì)小腸上皮形態(tài)學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞增多趨勢(shì)，且形態(tài)發(fā)生時(shí)相性改變。以上指標(biāo)在小腸不同部位發(fā)生變化的時(shí)相和程度并不一致，回腸較之空腸變化更顯著。至梗阻48h-72h

5、階段，血清瓜氨酸水平低于正常水平（p<0.05）。另外在對(duì)生化指標(biāo)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)CK發(fā)生顯著變化較早，相對(duì)其它指標(biāo)較為敏感（24h vs48h-72h）。 結(jié)論：①腸梗阻發(fā)生后的早期就已經(jīng)存在上皮的修復(fù)，表現(xiàn)為小腸組織ODC活性增高：②另外杯狀細(xì)胞可能參與了小腸粘膜的修復(fù)，并且可能是上皮修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞；③在梗阻后期隨著上皮增殖活性的降低，血清瓜氨酸水平這一間接指標(biāo)也隨之降低，說(shuō)明其對(duì)判斷小腸功能障礙嚴(yán)重程度具有一定參考價(jià)值；④在腸

6、梗阻發(fā)生后，CK相對(duì)其他生化指標(biāo)可能對(duì)腸實(shí)質(zhì)性損害更具有敏感的診斷提示意義。 實(shí)驗(yàn)三:小腸梗阻后腸腔內(nèi)環(huán)境及微生態(tài)變化 目的：觀察急性機(jī)械性低位小腸梗阻發(fā)生后腸道內(nèi)環(huán)境及微生態(tài)的改變，以了解腸梗阻發(fā)生后腸道自穩(wěn)態(tài)破壞與腸屏障破壞的時(shí)相性關(guān)系。 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Norm）、假手術(shù)組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻4

7、8h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。觀察梗阻后每一時(shí)段小腸內(nèi)PH、含水量及采用平板計(jì)數(shù)法了解腸桿菌科與雙歧桿菌菌群數(shù)量變化。另外在不同時(shí)段進(jìn)行血內(nèi)毒素水平、各臟器細(xì)菌移位陽(yáng)性率等進(jìn)行觀察。 結(jié)論：腸梗阻后腸功能障礙是對(duì)方面因素的綜合結(jié)果，其中腸道自穩(wěn)態(tài)的破壞為之后的細(xì)菌大量增殖、細(xì)菌和內(nèi)毒素移位提供了環(huán)境基礎(chǔ)。腸梗阻較早期的12h-24h階段可能是腸內(nèi)環(huán)境、微生態(tài)發(fā)生劇烈轉(zhuǎn)變的階段，同時(shí)也可能是細(xì)菌和內(nèi)毒素移位的

8、開始。而此時(shí)腸道機(jī)械屏障往往并沒有出現(xiàn)廣泛破壞，這更說(shuō)明機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障的破壞都是腸功能障礙的危險(xiǎn)因素。 實(shí)驗(yàn)四:腸梗阻對(duì)腸上皮Claudin1 mRNA表達(dá)的影響 目的：了解急性腸梗阻發(fā)生后腸道上皮細(xì)胞間緊密連接破壞的時(shí)相性特點(diǎn)。 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Norm）、假手術(shù)組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻

9、48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)動(dòng)物末段小腸上皮的緊密連接相關(guān)蛋白Claudin1的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行相對(duì)定量分析。 結(jié)論：腸梗阻發(fā)生后早期（6h）已經(jīng)發(fā)生機(jī)械屏障的破壞，表現(xiàn)為緊密連接蛋白上游基因的低表達(dá)，隨著梗阻進(jìn)展，這種低表達(dá)更加顯著，至梗阻48h-72h階段，這一基因的表達(dá)水平已經(jīng)很低。提示這一階段腸上皮的完整性已經(jīng)完全失去，腸道機(jī)械屏障破壞嚴(yán)重。 實(shí)驗(yàn)

10、五:腸梗阻家兔小腸免疫屏障功能的變化 目的：利用腸梗阻模型，觀察急性機(jī)械性腸梗阻的發(fā)生對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Norm）、假手術(shù)組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)梗阻近端低位回腸、高位空腸兩個(gè)不同部位小腸派伊爾淋巴結(jié)（PP）的CD3+、

11、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，利用HE染色切片計(jì)數(shù)上述兩個(gè)不同部位IEL和LPL的百分比于梗阻不同階段的變化。另外ELISA法檢測(cè)小腸內(nèi)分泌型免疫球蛋白A（S-IgA）含量。 結(jié)論：①腸梗阻發(fā)生后，小腸PP數(shù)量和總面積均增加，這可能與梗阻后受到更多炎性因素刺激有關(guān)，另外其內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群也出現(xiàn)相應(yīng)變化，CD3+呈不斷增多趨勢(shì)，CD4+亞群比例、CD4+/CD8+均在早期增多，而后隨著梗阻進(jìn)展逐漸下降。反之，CD8+亞群比

12、例早期降低，后期增高，這些都預(yù)示著腸道免疫的一過性增強(qiáng)和之后的減弱；②通過對(duì)上皮內(nèi)IEL、固有層LPL占總細(xì)胞數(shù)量百分比的統(tǒng)計(jì)，可以看出，IEL變化存在一定改變，但本實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。而LPL百分比特點(diǎn)也是梗阻早期增大，后期下降，這可能是淋巴細(xì)胞歸巢至固有層這一效應(yīng)部位增多有關(guān)，后期隨著淋巴細(xì)胞凋亡增多和其它大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而至其比例下降；③s-IgA的量的變化進(jìn)一步印證了上述現(xiàn)象，在早期腸腔內(nèi)增多，至后期逐漸低于正常水平；④腸

13、道免疫系統(tǒng)的激活是較早出現(xiàn)的，而且腸梗阻引發(fā)的腸免疫屏障改變可能存在部位上的差異，回腸更早、更強(qiáng)烈的出現(xiàn)免疫改變。而固有層效應(yīng)部位上淋巴細(xì)胞可能這種差異并不明顯，有待印證。 第二部分：四君子湯對(duì)腸梗阻解除后腸功能障礙的調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)六:四君子湯對(duì)腸梗阻解除后小腸上皮修復(fù)的調(diào)理作用 目的：利用可復(fù)性機(jī)械性完全性腸梗阻模型，觀察比較腸梗阻梗阻解除后自然恢復(fù)與中藥四君子湯對(duì)小腸上皮細(xì)胞增殖與修復(fù)的影響。

14、 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、梗阻48模型組（M48）、自然恢復(fù)48h組（S48）、中藥治療48h組（T48）、自然恢復(fù)96h組（S96）、中藥治療96h組（T96），每組6只。對(duì)動(dòng)物模型梗阻解除后48h、96h時(shí)腸杯狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)、小腸組織鳥氨酸脫羧酶活性、血清瓜氨酸水平、緊密連接相關(guān)蛋白Claudin1 mRNA表達(dá)等分別進(jìn)行檢測(cè)和觀察。 結(jié)論：①中藥四君子湯可以促進(jìn)腸梗阻解除后腸上皮細(xì)胞的再增殖和

15、上皮完整性的修復(fù)過程，表現(xiàn)為其可以加速腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞對(duì)腸上皮的重建的完成進(jìn)度；②可以提高小腸組織ODC活性，提示四君子湯能提高上皮再生能力；③而上皮再生后的結(jié)果體現(xiàn)為血清瓜氨酸水平的提高；④四君子湯可以上調(diào)腸上皮緊密連接相關(guān)蛋白Claudin1的上游基因表達(dá)，促進(jìn)腸上皮完整性的修復(fù)⑤通過結(jié)果說(shuō)明腸梗阻解除后的腸功能障礙在辨證上存在脾胃虛的情況，邪實(shí)已祛，正氣受損的實(shí)質(zhì)可能應(yīng)該包括腸上皮的損害，而四君子湯的作用靶點(diǎn)之一可能是促進(jìn)腸隱窩干

16、細(xì)胞的增殖從而達(dá)到上皮完整性的修復(fù)。 實(shí)驗(yàn)七: 四君子湯對(duì)腸梗阻解除后小腸免疫的調(diào)理作用 目的：利用可復(fù)性機(jī)械性完全性腸梗阻模型，觀察比較腸梗阻解除后自然恢復(fù)及中藥四君子湯對(duì)腸道免疫屏障的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、梗阻48模型組（M48）、自然恢復(fù)48h組（S48）、中藥治療48h組（T48）、自然恢復(fù)96h組（S96）、中藥治療96h組（T96），每組6只。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)動(dòng)

17、物模型梗阻解除后48h、96h時(shí)PP淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）進(jìn)行分析、利用ELISA法對(duì)腸道內(nèi)s-IgA含量進(jìn)行檢測(cè)以及通過病理切片對(duì)IEL、LPL百分比進(jìn)行計(jì)數(shù)。 結(jié)論：腸梗阻解除后小腸的免疫屏障功能紊亂并沒有立即恢復(fù)，自然恢復(fù)48h后CD4+、CD4+/CD8+比值等指標(biāo)并沒有隨之恢復(fù)，而卻較M48組更趨下降，這可能提示腸功能的免疫狀態(tài)并沒有因腸梗阻解除而立即恢復(fù)，這可能是腸道內(nèi)環(huán)境紊